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["無断転載を禁ずる　（国立医薬品食品衛生研究所）"]
["ref_ID","PMID","Animal/Plant\n動物/植物","Species\n種名","Techniques\n用いた技術","Target genes\n標的遺伝子","Journal\n雑誌名","Title\nタイトル","Year\n年","Vol/pages\n巻・号・ページ","Authors\n著者","Affiliations\n所属機関（国）","PMID","DOI","Abstract \n抄録 ","species2","Abstract (Jan)\n日本語抄録"]
[1,30038055,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","cadherin-like and PC-esterase domain containing 1","Bioscience reports","Cped1 promotes chicken SSCs formation with the aid of histone acetylation and transcription factor Sox2.",2018,"38(5)","[Zhang C et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, China.",30038055,"10.1042/BSR20180707 ","Spermatogonial stem cells (SSCs) may apply to gene therapy, regenerative medicine in place of embryonic stem cells (ESCs). However, the application of SSCs was severely limited by the low induction efficiency and the lack of thorough analysis of the regulatory mechanisms of SSCs formation. Current evidences have demonstrated multiple marker genes of germ cells, while genes that specifically regulate the formation of SSCs have not been explored. In our study, cadherin-like and PC-esterase domain containing 1 (Cped1) expressed specifically  in SSCs based on RNA-seq data analysis. To study the function of Cped1 in the formation of SSCs, we successfully established a CRISPR/Cas9 knockout system. The gene disruption frequency is 37% in DF1 and 25% in ESCs without off-target effects. Knockout of Cped1 could significantly inhibit the formation of SSCs in vivo and in vitro The fragment of -1050 to -1 bp had the activity as Cped1 gene promoter. Histone acetylation could regulate the expression of Cped1. We added 5-azaeytidi (DNA methylation inhibitors) and TSA (histone deacetylase inhibitors) respectively during the cultivation of SSCs. TSA was validated to promote the transcription of Cped1. Dual-luciferase reporter assay revealed that active control area of the chicken Cped1 gene is -296 to -1 bp. There are Cebpb, Sp1, and Sox2 transcription factor binding sites in this region. Point-mutation experiment results showed that Sox2 negatively regulates the transcription of Cped1. Above results demonstrated that Cped1 is a key gene that regulates the formation of SSCs. Histone acetylation and transcription factor Sox2 participate  in the regulation of Cped1.","chicken","精子幹細胞（SSC）は、胚性幹細胞（ESC）の代わりに、遺伝子治療、再生医療に適用される場合があります。ただし、SSCの適用は、低い誘導効率とSSC形成の調節メカニズムの徹底的な分析の欠如によって厳しく制限されていました。現在の証拠は、生殖細胞の複数のマーカー遺伝子を示していますが、SSCの形成を特異的に調節する遺伝子は調査されていません。私たちの研究では、RNA-seqデータ分析に基づいてSSCで特異的に発現した1（Cped1）を含むカドヘリン様およびPCエステラーゼドメイン。 SSCの形成におけるCped1の機能を研究するために、CRISPR / Cas9ノックアウトシステムの確立に成功しました。遺伝子破壊の頻度は、DF1で37％、ESCで25％であり、オフターゲット効果はありません。 Cped1のノックアウトは、invivoおよびinvitroでSSCの形成を有意に阻害する可能性があります。-1050〜-1 bpのフラグメントは、Cped1遺伝子プロモーターとしての活性を持っていました。ヒストンのアセチル化は、Cped1の発現を調節する可能性があります。 SSCの培養中に、5-アザエイチジ（DNAメチル化阻害剤）とTSA（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）をそれぞれ添加しました。 TSAは、Cped1の転写を促進することが検証されました。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ニワトリCped1遺伝子のアクティブコントロールエリアは-296〜-1bpであることが明らかになりました。この領域には、Cebpb、Sp1、およびSox2転写因子結合部位があります。点突然変異実験の結果は、Sox2がCped1の転写を負に調節することを示しました。上記の結果は、Cped1がSSCの形成を調節する重要な遺伝子であることを示しています。ヒストンのアセチル化と転写因子Sox2はCped1の調節に関与しています。"]
[2,29386245,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","transcription factors; enhancer","Development","Genome and epigenome engineering CRISPR toolkit for in vivo modulation of cis-regulatory interactions and gene expression in the chicken embryo.",2018,"145(4)","[Williams RM  et al.]","University of Oxford, Oxford, UK.",29386245,"10.1242/dev.160333 ","CRISPR/Cas9 genome engineering has revolutionised all aspects of biological research, with epigenome engineering transforming gene regulation studies. Here,  we present an optimised, adaptable toolkit enabling genome and epigenome engineering in the chicken embryo, and demonstrate its utility by probing gene regulatory interactions mediated by neural crest enhancers. First, we optimise novel efficient guide-RNA mini expression vectors utilising chick U6 promoters, provide a strategy for rapid somatic gene knockout and establish a protocol for evaluation of mutational penetrance by targeted next-generation sequencing. We show that CRISPR/Cas9-mediated disruption of transcription factors causes a reduction in their cognate enhancer-driven reporter activity. Next, we assess endogenous enhancer function using both enhancer deletion and nuclease-deficient  Cas9 (dCas9) effector fusions to modulate enhancer chromatin landscape, thus providing the first report of epigenome engineering in a developing embryo. Finally, we use the synergistic activation mediator (SAM) system to activate an endogenous target promoter. The novel genome and epigenome engineering toolkit developed here enables manipulation of endogenous gene expression and enhancer activity in chicken embryos, facilitating high-resolution analysis of gene regulatory interactions in vivo.","chicken","CRISPR / Cas9ゲノムエンジニアリングは、エピゲノムエンジニアリングが遺伝子調節研究を変革することで、生物学研究のあらゆる側面に革命をもたらしました。ここでは、ニワトリ胚のゲノムおよびエピゲノムエンジニアリングを可能にする最適化された適応可能なツールキットを提示し、神経堤エンハンサーによって媒介される遺伝子調節相互作用を精査することによってその有用性を示します。まず、ニワトリU6プロモーターを利用した新規の効率的なガイドRNAミニ発現ベクターを最適化し、迅速な体細胞遺伝子ノックアウトの戦略を提供し、ターゲットを絞った次世代シーケンシングによる変異浸透度の評価プロトコルを確立します。CRISPR / Cas9を介した転写因子の破壊が、同族のエンハンサー駆動型レポーター活性の低下を引き起こすことを示します。次に、エンハンサーの削除とヌクレアーゼ欠損Cas9（dCas9）エフェクター融合の両方を使用して内因性エンハンサー機能を評価し、エンハンサーのクロマチンランドスケープを調節して、発生中の胚におけるエピゲノムエンジニアリングの最初のレポートを提供します。最後に、相乗的活性化メディエーター（SAM）システムを使用して、内因性の標的プロモーターを活性化します。ここで開発された新しいゲノムおよびエピゲノムエンジニアリングツールキットは、ニワトリ胚における内因性遺伝子発現およびエンハンサー活性の操作を可能にし、invivoでの遺伝子調節相互作用の高解像度分析を容易にします。"]
[3,29946437,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","GAPDH","F1000Research","Successful CRISPR/Cas9 mediated homologous recombination in a chicken cell line.",2018,"7:238","[Antonova E  et al.]","Moscow Institute of Physics and Technology, Moscow Region, Russian Federation.",29946437,"10.12688/f1000research.13457.2 ","Background: CRISPR/Cas9 system is becoming the dominant genome editing tool in a  variety of organisms. CRISPR/Cas9 mediated knock out has been demonstrated both in chicken cell lines and in chicken germ cells that served to generate genetically modified birds. However, there is limited data about CRISPR/Cas9 dependent homology directed repair (HDR) for avian, even in cell culture. Few attempts have been made with integrations in safe harbor loci of chicken genome that induces constitutive expression of the inserted gene. Gene expression under  an endogenous promoter would be more valuable than under a constitutive exogenous promoter, as it allows the gene expression to be tissue-specific. Methods: Three  gRNAs were chosen to target chicken 3'-untranslated region of GAPDH gene. Cas9-mediated activity in the targeted locus for the gRNAs in DF-1 cells was estimated by T7E1 assay. To edit the locus, the HDR cassette was added along with CRISPR/Cas9. The inserted sequence contained eGFP in frame with a GAPDH coding sequence via P2A and Neomycin resistance gene ( neoR) under cytomegalovirus promoter. Correct integration of the cassette was confirmed with fluorescent microscopy, PCR analysis and sequencing. Enrichment of modified cells was done by G418 selection. Efficiency of integration was assessed with fluorescence activated cell sorting (FACS). Results: We have established a CRISPR/Cas9 system  to target an endogenous locus and precisely insert a gene under endogenous control. In our system, we used positive and negative selection to enrich modified cells and remove cells with undesirable insertions. The efficiency of CRISPR/Cas9-mediated HDR was increased up to 90% via G418 enrichment. We have successfully inserted eGFP under control of the chicken GAPDH promoter. Conclusions: The approach can be used further to insert genes of interest under control of tissue-specific promoters in primordial germ cells in order to produce genetically modified birds with useful for biotechnological purposes features.","chicken","背景：CRISPR / Cas9システムは、さまざまな生物の主要なゲノム編集ツールになりつつあります。CRISPR / Cas9を介したノックアウトは、ニワトリ細胞株と、遺伝子組み換え鳥の生成に役立つニワトリ生殖細胞の両方で実証されています。ただし、細胞培養においても、鳥類のCRISPR / Cas9依存性相同組換え修復（HDR）に関するデータは限られています。挿入された遺伝子の構成的発現を誘導するニワトリゲノムのセーフハーバー遺伝子座への統合に関する試みはほとんど行われていません。内因性プロモーター下での遺伝子発現は、遺伝子発現を組織特異的にすることができるため、構成的外因性プロモーター下よりも価値があります。方法：GAPDH遺伝子のニワトリ3 '非翻訳領域を標的とするために3つのgRNAを選択しました。DF-1細胞のgRNAの標的遺伝子座におけるCas9を介した活性は、T7E1アッセイによって推定されました。遺伝子座を編集するために、HDRカセットがCRISPR / Cas9とともに追加されました。挿入された配列は、サイトメガロウイルスプロモーター下のP2Aおよびネオマイシン耐性遺伝子（neoR）を介したGAPDHコード配列とインフレームでeGFPを含んでいました。カセットの正しい統合は、蛍光顕微鏡、PCR分析および配列決定で確認されました。改変細胞の濃縮は、G418選択によって行われた。統合の効率は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）で評価されました。結果：内因性遺伝子座を標的とし、内因性制御下で遺伝子を正確に挿入するためのCRISPR / Cas9システムを確立しました。私たちのシステムでは、ポジティブセレクションとネガティブセレクションを使用して、修飾細胞を濃縮し、望ましくない挿入のある細胞を除去しました。CRISPR / Cas9を介したHDRの効率は、G418エンリッチメントによって最大90％向上しました。ニワトリGAPDHプロモーターの制御下でeGFPを挿入することに成功しました。結論：このアプローチは、生物工学的目的に有用な遺伝子改変鳥を生産するために、原始生殖細胞に組織特異的プロモーターの制御下で目的の遺伝子を挿入するためにさらに使用することができます。"]
[4,30662438,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","TANK-binding kinase 1  (TBK-1)","Frontiers in immunology","CRISPR/Cas9-Mediated Chicken TBK1 Gene Knockout and Its Essential Role in STING-Mediated IFN-beta Induction in Chicken Cells.",2018,"9:3010","[Cheng Y et al.]","Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China.",30662438,"10.3389/fimmu.2018.03010 ","TANK-binding kinase 1 (TBK1) is involved in innate immunity, prompting transcriptional induction of type I interferons in response to pathogenic infection. Many studies have focused on mammals but the function of TBK1 in chickens remains poorly defined. CRISPR/Cas9 system has made gene-knockout easy to accomplish. Although CRISPR/Cas9 has been used in chicken cells, low mutation  efficiency limits its wide application in chickens. In this study, an effective gene-knockout system was developed based on the CRISPR/Cas9 system in chicken embryonic fibroblast DF-1. Two CRISPR/Cas9 plasmids were constructed, TBK1-g1 and TBK1-g2, which express gRNAs targeting different sequences of the chicken TBK1 gene. After transfection and enrichment with puromycin screening, the mutation rates as assessed via T7E1 assay were 88.05 and 89.55%, respectively, and subsequent sequence analysis showed mutation efficiencies of 86.67 and 93.33%. With the limiting-dilution method, a chTBK1 gene-deficiency monoclonal cell line  was obtained and was named DF-1-TBK1-C3. The DF-1-TBK1-C3 cells exhibited normal  morphology and maintained stable proliferation ability compared to wild-type cells. The gene-overexpression system and luciferase reporter assay showed that IFN-beta induction induced by chSTING was almost completely blocked in DF-1-TBK1-C3 cells. With quantitative real-time PCR, we further confirmed the essential role of chTBK1 in the chSTING-mediated IFN-beta induction. At last, the study demonstrated that the chTBK1 knockout system is also applicable in primary  chick embryo fibroblasts (CEFs). In this study, an effective gene-knockout system was applied in chickens, a TBK1 gene-deleted DF-1 cell line was successfully created using this system, and with the chTBK1 knockout cells, chTBK1 was revealed to be indispensable in STING-mediated IFN-beta activation in chicken cells.","chicken","TANK結合キナーゼ1（TBK1）は自然免疫に関与しており、病原性感染に応答してI型インターフェロンの転写誘導を促します。多くの研究は哺乳類に焦点を合わせていますが、ニワトリにおけるTBK1の機能は十分に定義されていないままです。CRISPR / Cas9システムにより、遺伝子ノックアウトが容易になりました。CRISPR / Cas9はニワトリ細胞で使用されてきましたが、突然変異効率が低いため、ニワトリでの幅広い用途が制限されています。この研究では、ニワトリ胚性線維芽細胞DF-1のCRISPR / Cas9システムに基づいて効果的な遺伝子ノックアウトシステムが開発されました。2つのCRISPR / Cas9プラスミド、TBK1-g1とTBK1-g2が構築されました。これらは、ニワトリTBK1遺伝子の異なる配列を標的とするgRNAを発現します。トランスフェクションとピューロマイシンスクリーニングによる濃縮後、T7E1アッセイで評価した変異率はそれぞれ88.05と89.55％であり、その後の配列分析では86.67と93.33％の変異効率が示されました。限界希釈法により、chTBK1遺伝子欠損モノクローナル細胞株が得られ、DF-1-TBK1-C3と名付けられました。DF-1-TBK1-C3細胞は、野生型細胞と比較して、正常な形態を示し、安定した増殖能力を維持していました。遺伝子過剰発現システムとルシフェラーゼレポーターアッセイは、chSTINGによって誘導されたIFN-ベータ誘導がDF-1-TBK1-C3細胞でほぼ完全にブロックされたことを示しました。定量的リアルタイムPCRにより、chSTINGを介したIFN-beta誘導におけるchTBK1の重要な役割をさらに確認しました。最後に、この研究は、chTBK1ノックアウトシステムが初代ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）にも適用可能であることを示しました。この研究では、効果的な遺伝子ノックアウトシステムがニワトリに適用され、TBK1遺伝子が削除されたDF-1細胞株がこのシステムを使用して正常に作成され、chTBK1ノックアウト細胞により、chTBK1がSTINGを介したIFNに不可欠であることが明らかになりました。 -ニワトリ細胞におけるベータ活性化。"]
[5,29143989,"animal","chicken","Cas9","Nanos2","Journal of cellular biochemistry","Nanos2 promotes differentiation of chicken (Gallus gallus) embryonic stem cells to male germ cells.",2018,"119(6):4435-4446","[Zhang W et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu, China.",29143989,"10.1002/jcb.26528 ","Nanos2 is an evolutionarily conserved RNA-binding protein containing 2 CCHC-type  zinc finger motives. Here, we report that Nanos2 is strongly expressed in the testis compared to other tissues in chicken (Gallus gallus). Overexpression and knockout plasmid vectors were constructed, and in-vitro Cas9/gRNA digestion and T7 endonuclease I (T7E1) assay indicated that Nanos2-g1 possessed the highest knockout activity. In vitro and in vivo, Nanos2 overexpression accelerated the production of embryoid bodies (EBs) and SSC-like cells and promoted cvh, c-kit, and integrin alpha6 expression. Immunofluorescence staining, periodic acid schiff (PAS) and flow cytometry (FCM) assay showed that primordial germ cells (PGCs) and spermatogonial stem cells (SSCs) formation were significantly promoted. On the contrary, Nanos2 knockout delayed the production of EBs and SSC-like cells and correspondingly reduced cvh, c-kit, and integrin alpha6 expression. Simultaneously, the quantity of PGCs and SSCs was blocked. Collectively, these results uncovered a novel function of Nanos2 involved in chicken male germ cell differentiation, where it acts as a facilitator.","chicken","Nanos2は、2つのCCHCタイプの亜鉛フィンガー動機を含む進化的に保存されたRNA結合タンパク質です。ここでは、Nanos2がニワトリ（Gallus gallus）の他の組織と比較して精巣で強く発現していることを報告します。過剰発現およびノックアウトプラスミドベクターが構築され、インビトロCas9 / gRNA消化およびT7エンドヌクレアーゼI（T7E1）アッセイは、Nanos2-g1が最高のノックアウト活性を有することを示した。invitroおよびinvivoでは、Nanos2の過剰発現により、胚様体（EB）およびSSC様細胞の産生が促進され、cvh、c-kit、およびインテグリンalpha6の発現が促進されました。免疫蛍光染色、過ヨウ素酸シッフ（PAS）およびフローサイトメトリー（FCM）アッセイは、始原生殖細胞（PGC）および精原幹細胞（SSC）の形成が有意に促進されたことを示しました。それどころか、Nanos2ノックアウトは、EBおよびSSC様細胞の産生を遅らせ、それに応じてcvh、c-kit、およびインテグリンalpha6の発現を低下させました。同時に、PGCとSSCの量がブロックされました。まとめると、これらの結果は、ニワトリの雄の生殖細胞の分化に関与するNanos2の新しい機能を明らかにし、ファシリテーターとして機能します。"]
[6,28978766,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","transient receptor potential canonical channel (TRPC5)","Journal of neurophysiology","TRPC5 is required for the NO-dependent increase in dendritic Ca(2+) and GABA release from chick retinal amacrine cells.",2018,"119(1):262-273","[Maddox JW  et al.]","Louisiana State University , Baton Rouge, La, USA.",28978766,"10.1152/jn.00500.2017 ","GABAergic signaling from amacrine cells (ACs) is a fundamental aspect of visual signal processing in the inner retina. We have previously shown that nitric oxide (NO) can elicit release of GABA independently from activation of voltage-gated Ca(2+) channels in cultured retinal ACs. This voltage-independent quantal GABA release relies on a Ca(2+) influx mechanism with pharmacological characteristics  consistent with the involvement of the transient receptor potential canonical (TRPC) channels TRPC4 and/or TRPC5. To determine the identity of these channels,  we evaluated the ability of NO to elevate dendritic Ca(2+) and to stimulate GABA  release from cultured ACs under conditions known to alter the function of TRPC4 and 5. We found that these effects of NO are phospholipase C dependent, have a biphasic dependence on La(3+), and are unaffected by moderate concentrations of the TRPC4-selective antagonist ML204. Together, these results suggest that NO promotes GABA release by activating TRPC5 channels in AC dendrites. To confirm a  role for TRPC5, we knocked down the expression of TRPC5 using CRISPR/Cas9-mediated gene knockdown and found that both the NO-dependent Ca(2+) elevations and increase in GABA release are dependent on the expression of TRPC5. These results demonstrate a novel NO-dependent mechanism for regulating neurotransmitter output from retinal ACs. NEW & NOTEWORTHY Elucidating the mechanisms regulating GABAergic synaptic transmission in the inner retina is key  to understanding the flexibility of retinal ganglion cell output. Here, we demonstrate that nitric oxide (NO) can activate a transient receptor potential canonical 5 (TRPC5)-mediated Ca(2+) influx, which is sufficient to drive vesicular GABA release from retinal amacrine cells. This NO-dependent mechanism can bypass the need for depolarization and may have an important role in processing the visual signal by enhancing retinal amacrine cell GABAergic inhibitory output.","chicken","アマクリン細胞（AC）からのGABA作動性シグナル伝達は、網膜内の視覚信号処理の基本的な側面です。一酸化窒素（NO）は、培養網膜ACの電位依存性Ca（2+）チャネルの活性化とは独立してGABAの放出を誘発できることを以前に示しました。この電圧に依存しない量子GABA放出は、一過性受容体電位カノニカル（TRPC）チャネルTRPC4および/またはTRPC5の関与と一致する薬理学的特性を備えたCa（2+）流入メカニズムに依存しています。これらのチャネルのアイデンティティを決定するために、樹状突起Ca（2+）を上昇させ、TRPC4および5の機能を変化させることが知られている条件下で培養ACからのGABA放出を刺激するNOの能力を評価しました。ホスホリパーゼC依存性、La（3+）への二相性依存性があり、中程度の濃度のTRPC4選択的アンタゴニストML204の影響を受けません。一緒に、これらの結果は、NOがAC樹状突起のTRPC5チャネルを活性化することによってGABA放出を促進することを示唆している。TRPC5の役割を確認するために、CRISPR / Cas9を介した遺伝子ノックダウンを使用してTRPC5の発現をノックダウンし、NO依存性のCa（2+）の上昇とGABA放出の増加の両方がTRPC5の発現に依存することを発見しました。これらの結果は、網膜ACからの神経伝達物質出力を調節するための新しいNO依存メカニズムを示しています。NEW＆NOTEWORTHY網膜内のGABA作動性シナプス伝達を調節するメカニズムを解明することは、網膜神経節細胞出力の柔軟性を理解するための鍵です。ここでは、一酸化窒素（NO）が網膜アマクリン細胞からの小胞GABA放出を駆動するのに十分な一過性受容器電位カノニカル5（TRPC5）を介したCa（2+）流入を活性化できることを示しています。このNO依存性メカニズムは、脱分極の必要性を回避することができ、網膜アマクリン細胞のGABA作動性抑制性出力を増強することによって視覚信号を処理する上で重要な役割を果たしている可能性があります。"]
[7,30310080,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;"," ","Scientific reports","High fidelity CRISPR/Cas9 increases precise monoallelic and biallelic editing events in primordial germ cells.",2018,"8(1):15126","[Idoko-Akoh A et al.]","University of Edinburgh, Midlothian, UK.",30310080,"10.1038/s41598-018-33244-x ","Primordial germ cells (PGCs), the embryonic precursors of the sperm and egg, are  used for the introduction of genetic modifications into avian genome. Introduction of small defined sequences using genome editing has not been demonstrated in bird species. Here, we compared oligonucleotide-mediated HDR using wild type SpCas9 (SpCas9-WT) and high fidelity SpCas9-HF1 in PGCs and show  that many loci in chicken PGCs can be precise edited using donors containing CRISPR/Cas9-blocking mutations positioned in the protospacer adjacent motif (PAM). However, targeting was more efficient using SpCas9-HF1 when mutations were introduced only into the gRNA target sequence. We subsequently employed an eGFP-to-BFP conversion assay, to directly compare HDR mediated by SpCas9-WT and SpCas9-HF1 and discovered that SpCas9-HF1 increases HDR while reducing INDEL formation. Furthermore, SpCas9-HF1 increases the frequency of single allele editing in comparison to SpCas9-WT. We used SpCas9-HF1 to demonstrate the introduction of monoallelic and biallelic point mutations into the FGF20 gene and generate clonal populations of edited PGCs with defined homozygous and heterozygous genotypes. Our results demonstrate the use of oligonucleotide donors and high fidelity CRISPR/Cas9 variants to perform precise genome editing with high efficiency in PGCs.","chicken","精子と卵子の胚性前駆細胞である始原生殖細胞（PGC）は、鳥類のゲノムに遺伝子組み換えを導入するために使用されます。ゲノム編集を使用した小さな定義された配列の導入は、鳥類では実証されていません。ここでは、PGCで野生型SpCas9（SpCas9-WT）と高忠実度SpCas9-HF1を使用してオリゴヌクレオチドを介したHDRを比較し、プロトスペーサーに配置されたCRISPR / Cas9ブロッキング変異を含むドナーを使用してニワトリPGCの多くの遺伝子座を正確に編集できることを示します隣接モチーフ（PAM）。ただし、変異がgRNAターゲット配列にのみ導入された場合、SpCas9-HF1を使用した方がターゲティングはより効率的でした。その後、eGFPからBFPへの変換アッセイを採用して、SpCas9-WTとSpCas9-HF1によって媒介されるHDRを直接比較し、SpCas9-HF1がHDRを増加させ、INDEL形成を減少させることを発見しました。さらに、SpCas9-HF1は、SpCas9-WTと比較して単一対立遺伝子編集の頻度を高めます。SpCas9-HF1を使用して、FGF20遺伝子へのモノアレリックおよびバイアレリック点突然変異の導入を実証し、定義されたホモ接合およびヘテロ接合の遺伝子型を持つ編集されたPGCのクローン集団を生成しました。私たちの結果は、PGCで高効率で正確なゲノム編集を実行するためのオリゴヌクレオチドドナーと忠実度の高いCRISPR / Cas9バリアントの使用を示しています。"]
[8,29976933,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","human interferon beta","Scientific reports","Efficient production of human interferon beta in the white of eggs from ovalbumin gene-targeted hens.",2018,"8(1):10203","[Oishi I et al.]","National Institute of Advanced Industrial Science  and Technology, Ikeda, Osaka, Japan.",29976933,"10.1038/s41598-018-28438-2 ","Transgenic chickens could potentially serve as bioreactors for commercial production of recombinant proteins in egg white. Many transgenic chickens have been generated by randomly integrating viral vectors into their genomes, but transgene expression has proved insufficient and/or limited to the initial cohort. Herein, we demonstrate the feasibility of integrating human interferon beta (hIFN-beta) into the chicken ovalbumin locus and producing hIFN-beta in egg  white. We knocked in hIFN-beta into primordial germ cells using a CRISPR/Cas9 protocol and then generated germline chimeric roosters by cell transplantation into recipient embryos. Two generation-zero founder roosters produced hIFN-beta knock-in offspring, and all knock-in female offspring produced abundant egg-white hIFN-beta (~3.5 mg/ml). Although female offspring of the first generation were sterile, their male counterparts were fertile and produced a second generation of knock-in hens, for which egg-white hIFN-beta production was comparable with that  of the first generation. The hIFN-beta bioactivity represented only ~5% of total  egg-white hIFN-beta, but unfolding and refolding of hIFN-beta in the egg white fully recovered the bioactivity. These results suggest that transgene insertion at the chicken ovalbumin locus can result in abundant and stable expression of an exogenous protein deposited into egg white and should be amenable to industrial applications.","chicken","トランスジェニックニワトリは、卵白で組換えタンパク質を商業生産するためのバイオリアクターとして役立つ可能性があります。多くのトランスジェニックニワトリは、ウイルスベクターをゲノムにランダムに組み込むことによって生成されていますが、導入遺伝子の発現は不十分であるか、最初のコホートに限定されていることが証明されています。ここでは、人間のインターフェロンベータ（hIFN-ベータ）をニワトリの卵白遺伝子座に統合し、卵白でhIFN-ベータを生成する可能性を示しています。CRISPR / Cas9プロトコルを使用してhIFN-betaを原始生殖細胞にノックインし、レシピエント胚への細胞移植によって生殖系列キメラオンドリを生成しました。2世代ゼロの創始者の雄鶏はhIFN-ベータノックイン子孫を産み、すべてのノックイン雌子孫は豊富な卵白hIFN-ベータ（〜3.5mg / ml）を産みました。第一世代の雌の子孫は不妊でしたが、雄の子孫は繁殖力があり、卵白のhIFN-ベータ生産が第一世代のそれと同等である第2世代のノックイン雌鶏を生産しました。hIFN-ベータの生物活性は、卵白全体のhIFN-ベータの約5％にすぎませんでしたが、卵白でのhIFN-ベータのアンフォールディングとリフォールディングにより、生物活性は完全に回復しました。これらの結果は、ニワトリのオボアルブミン遺伝子座への導入遺伝子の挿入が、卵白に沈着した外因性タンパク質の豊富で安定した発現をもたらす可能性があり、産業用途に適しているはずであることを示唆している。"]
[9,29717152,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","IFN-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5","Scientific reports","Chicken Interferon-induced Protein with Tetratricopeptide Repeats 5 Antagonizes Replication of RNA Viruses.",2018,"8(1):6794","[Santhakumar D et al.]","Lancaster University, Lancaster, UK.",29717152,"10.1038/s41598-018-24905-y ","The intracellular actions of interferon (IFN)-regulated proteins, including IFN-induced proteins with tetratricopeptide repeats (IFITs), attribute a major component of the protective antiviral host defense. Here we applied genomics approaches to annotate the chicken IFIT locus and currently identified a single IFIT (chIFIT5) gene. The profound transcriptional level of this effector of innate immunity was mapped within its unique cis-acting elements. This highly virus- and IFN-responsive chIFIT5 protein interacted with negative sense viral RNA structures that carried a triphosphate group on its 5' terminus (ppp-RNA). This interaction reduced the replication of RNA viruses in lentivirus-mediated IFIT5-stable chicken fibroblasts whereas CRISPR/Cas9-edited chIFIT5 gene knockout fibroblasts supported the replication of RNA viruses. Finally, we generated mosaic transgenic chicken embryos stably expressing chIFIT5 protein or knocked-down for endogenous chIFIT5 gene. Replication kinetics of RNA viruses in  these transgenic chicken embryos demonstrated the antiviral potential of chIFIT5  in ovo. Taken together, these findings propose that IFIT5 specifically antagonize RNA viruses by sequestering viral nucleic acids in chickens, which are unique in  innate immune sensing and responses to viruses of both poultry and human health significance.","chicken","インターフェロン（IFN）調節タンパク質の細胞内作用は、テトラトリコペプチドリピート（IFIT）を伴うIFN誘導タンパク質を含み、防御的抗ウイルス宿主防御の主要な構成要素に起因します。ここでは、ゲノミクスアプローチを適用して、ニワトリのIFIT遺伝子座に注釈を付け、現在、単一のIFIT（chIFIT5）遺伝子を特定しました。自然免疫のこのエフェクターの深遠な転写レベルは、そのユニークなシス作用エレメント内にマッピングされました。このウイルスおよびIFN応答性の高いchIFIT5タンパク質は、5 '末端に三リン酸基を有するネガティブセンスウイルスRNA構造（ppp-RNA）と相互作用しました。この相互作用により、レンチウイルスを介したIFIT5安定ニワトリ線維芽細胞におけるRNAウイルスの複製が減少しましたが、CRISPR / Cas9で編集されたchIFIT5遺伝子ノックアウト線維芽細胞はRNAウイルスの複製をサポートしていました。最後に、chIFIT5タンパク質を安定して発現するモザイクトランスジェニックニワトリ胚を生成するか、内因性chIFIT5遺伝子をノックダウンしました。これらのトランスジェニックニワトリ胚におけるRNAウイルスの複製動態は、卵内でのchIFIT5の抗ウイルス能を示した。まとめると、これらの発見は、IFIT5がニワトリのウイルス核酸を隔離することによってRNAウイルスに特異的に拮抗することを示唆しています。これは、家禽と人間の健康に重要なウイルスに対する自然免疫感知と応答において独特です。"]
[10,30400152,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","tva; tvc; tvj","Viruses","Genetic Resistance to Avian Leukosis Viruses Induced by CRISPR/Cas9 Editing of Specific Receptor Genes in Chicken Cells.",2018,"10(11)","[Koslova A et al.]","Institute of Molecular Genetics, Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Republic.",30400152,"10.3390/v10110605 ","Avian leukosis viruses (ALVs), which are pathogens of concern in domestic poultry, utilize specific receptor proteins for cell entry that are both necessary and sufficient for host susceptibility to a given ALV subgroup. This unequivocal relationship offers receptors as suitable targets of selection and biotechnological manipulation with the aim of obtaining virus-resistant poultry.  This approach is further supported by the existence of natural knock-outs of receptor genes that segregate in inbred lines of chickens. We used CRISPR/Cas9 genome editing tools to introduce frame-shifting indel mutations into tva, tvc, and tvj loci encoding receptors for the A, C, and J ALV subgroups, respectively.  For all three loci, the homozygous frame-shifting indels generating premature stop codons induced phenotypes which were fully resistant to the virus of respective subgroup. In the tvj locus, we also obtained in-frame deletions corroborating the importance of W38 and the four amino-acids preceding it. We demonstrate that CRISPR/Cas9-mediated knock-out or the fine editing of ALV receptor genes might be the first step in the development of virus-resistant chickens.","chicken","家禽で懸念される病原体であるトリ白血病ウイルス（ALV）は、特定のALVサブグループに対する宿主の感受性に必要かつ十分な特定の受容体タンパク質を細胞侵入に利用します。この明確な関係は、ウイルス耐性の家禽を得ることを目的とした選択および生物工学的操作の適切な標的として受容体を提供します。このアプローチは、近交系のニワトリに分離する受容体遺伝子の自然なノックアウトの存在によってさらにサポートされます。CRISPR / Cas9ゲノム編集ツールを使用して、フレームシフトインデル変異をA、C、およびJ ALVサブグループの受容体をコードするtva、tvc、およびtvj遺伝子座にそれぞれ導入しました。3つの遺伝子座すべてについて、時期尚早の終止コドンを生成するホモ接合性のフレームシフトインデルは、それぞれのサブグループのウイルスに完全に耐性のある表現型を誘導しました。tvj遺伝子座では、W38とそれに先行する4つのアミノ酸の重要性を裏付けるインフレーム欠失も取得しました。CRISPR / Cas9を介したノックアウトまたはALV受容体遺伝子の微編集が、ウイルス耐性ニワトリの開発の最初のステップである可能性があることを示しています。"]
[11,29696735,"animal","cow","CRISPR;Cas9;","collagen type VIII alpha 1 chain (COL8A1)","Cell biology international","Effects of COL8A1 on the proliferation of muscle-derived satellite cells.",2018,"42(9):1132-1140","[Li X et al.]","North-east Agricultural University, Harbin, China.",29696735,"10.1002/cbin.10979 ","Collagen type VIII alpha 1 chain (COL8A1) is a component of the extracellular matrix. Our previous studies suggested that COL8A1 is associated with the proliferation of muscle-derived satellite cells (MDSCs). Additionally, it has been demonstrated that COL8A1 promotes the proliferation of smooth muscle cells and liver cancer cells. Therefore, we predicted that COL8A1 is associated with the proliferation of bovine MDSCs, which have potential applications in research. In this study, we constructed vectors to activate and repress COL8A1 in bovine MDSCs using the CRISPR/Cas9 technique and determined the effects of COL8A1 modulation by EdU labeling, Western blotting, and dual-luciferase reporter assays. The results showed that activation of COL8A1 increased the number of EdU-positive cells and expression of the proliferation markers cyclin B1 (CCNB1)  and P-AKT. The expression of P-Akt was unchanged after addition of LY294002 (a protein kinase inhibitor capable of blocking the signal transduction pathway of the phosphoinositide 3-kinase). In contrast, repression of COL8A1 reduced the number of EdU-positive cells and expression of CCNB1 and P-AKT. We also observed  upregulation and downregulation of COL8A1 following the overexpression and repression of EGR1, respectively. The dual-luciferase reporter assay revealed that EGR1 regulates the promoter activity of COL8A1. To our knowledge, this is the first study demonstrating that EGR1 positively regulates the expression of COL8A1, which in turn promotes the proliferation of bovine MDSCs via the PI3 K/AKT signaling pathway.","cow","コラーゲンタイプVIIIアルファ1鎖（COL8A1）は、細胞外マトリックスの成分です。私たちの以前の研究は、COL8A1が筋肉由来衛星細胞（MDSC）の増殖に関連していることを示唆しました。さらに、COL8A1は平滑筋細胞と肝癌細胞の増殖を促進することが実証されています。したがって、COL8A1は、研究に応用できる可能性のあるウシMDSCの増殖に関連していると予測しました。この研究では、CRISPR / Cas9技術を使用してウシMDSCでCOL8A1を活性化および抑制するベクターを構築し、EdUラベリング、ウエスタンブロッティング、およびデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによってCOL8A1調節の効果を決定しました。結果は、COL8A1の活性化がEdU陽性細胞の数と増殖マーカーサイクリンB1（CCNB1）とP-AKTの発現を増加させることを示しました。P-Aktの発現は、LY294002（ホスホイノシチド3-キナーゼのシグナル伝達経路を遮断できるプロテインキナーゼ阻害剤）の添加後も変化しませんでした。対照的に、COL8A1の抑制は、EdU陽性細胞の数とCCNB1およびP-AKTの発現を減少させました。また、EGR1の過剰発現と抑制に続いて、COL8A1のアップレギュレーションとダウンレギュレーションがそれぞれ観察されました。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイは、EGR1がCOL8A1のプロモーター活性を調節することを明らかにしました。私たちの知る限り、これはEGR1がCOL8A1の発現を正に調節し、それがPI3 K / AKTシグナル伝達経路を介してウシMDSCの増殖を促進することを実証する最初の研究です。"]
[12,29274297,"animal","cow","CRISPR;Cas9;","extracellular matrix protein 2","Cell biology international","Effect of ECM2 expression on bovine skeletal muscle-derived satellite cell differentiation.",2018,"42(5):525-532","[Liu C et al.]","Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang, China.",29274297,"10.1002/cbin.10927 ","Extracellular matrix components have important regulatory functions during cell proliferation and differentiation. In recent study, extracellular matrix were shown to have a strong effect on skeletal muscle differentiation. Here, we aimed  to elucidate the effects of extracellular matrix protein 2 (ECM2), an extracellular matrix component, on the differentiation of bovine skeletal muscle-derived satellite cells (MDSCs). Western blot and immunofluorescence analyses were used to elucidate the ECM2 expression pattern in bovine MDSCs during differentiation in vitro. CRISPR/Cas9 technology was used to activate or inhibit ECM2 expression to study its effects on the in vitro differentiation of bovine MDSCs. ECM2 expression was shown to increase gradually during bovine MDSC  differentiation, and the levels of this protein were higher in more highly differentiated myotubes. ECM2 activation promoted MDSC differentiation, whereas its suppression inhibited the differentiation of these cells. Here, for the first time, we demonstrated the importance of ECM2 expression during bovine MDSC differentiation; these results could lead to treatments that help to increase beef cattle muscularity.","cow","細胞外マトリックス成分は、細胞の増殖と分化の際に重要な調節機能を持っています。最近の研究では、細胞外マトリックスが骨格筋の分化に強い影響を与えることが示されました。ここでは、ウシ骨格筋由来衛星細胞（MDSCs）の分化に及ぼす細胞外マトリックス成分である細胞外マトリックスタンパク質2（ECM2）の影響を解明することを目的とした。ウエスタンブロットおよび免疫蛍光分析を使用して、invitroでの分化中のウシMDSCにおけるECM2発現パターンを解明した。CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してECM2の発現を活性化または阻害し、ウシMDSCのinvitro分化への影響を研究しました。ECM2の発現は、ウシのMDSC分化中に徐々に増加することが示され、このタンパク質のレベルは、より高度に分化した筋管でより高かった。ECM2の活性化はMDSCの分化を促進しましたが、その抑制はこれらの細胞の分化を阻害しました。ここでは、初めて、ウシMDSC分化中のECM2発現の重要性を示しました。これらの結果は、肉牛の筋肉質を高めるのに役立つ治療につながる可能性があります。"]
[13,30087667,"animal","cow","CRISPR;","apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain","Frontiers in microbiology","Lactobacillus rhamnosus GR-1 Ameliorates Escherichia coli-Induced Activation of NLRP3 and NLRC4 Inflammasomes With Differential Requirement for ASC.",2018,"9:1661","[Wu Q et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30087667,"10.3389/fmicb.2018.01661 ","Escherichia coli is a common cause of mastitis in dairy cows. The adaptor protein apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) synergizes with caspase-1 to regulate inflammasome activation during pathogen infection. Here, the ASC gene was knocked out in bovine mammary epithelial (MAC-T) cells using clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)-9 technology. MAC-T cells were pre-incubated with and without Lactobacillus rhamnosus GR-1 and then exposed to E. coli. Western blot analysis demonstrated increased expression of NLRP3 and  NLRC4 following E. coli infection, but this increase was attenuated by pre-incubation with L. rhamnosus GR-1, regardless of ASC knockout. Western blot and immunofluorescence analyses revealed that pre-incubation with L. rhamnosus GR-1 decreased E. coli-induced caspase-1 activation at 6 h after E. coli infection, as also observed in ASC-knockout MAC-T cells. The E. coli-induced increase in caspase-4 mRNA expression was inhibited by pre-incubation with L. rhamnosus GR-1. ASC knockout diminished, but did not completely prevent, increased production of IL-1beta and IL-18 and cell pyroptosis associated with E. coli infection, whereas pre-incubation with L. rhamnosus GR-1 inhibited this increase. Our data indicate that L. rhamnosus GR-1 suppresses activation of ASC-dependent NLRP3 and NLRC4 inflammasomes and production of downstream IL-lbeta and IL-18 during E. coli infection. L. rhamnosus GR-1 also inhibited E. coli-induced cell pyroptosis, in part through attenuation of NLRC4 and non-canonical caspase-4 activation independently of ASC.","cow","大腸菌は乳牛の乳房炎の一般的な原因です。カスパーゼ動員ドメイン（ASC）を含むアダプタータンパク質アポトーシス関連スペック様タンパク質は、カスパーゼ-1と相乗作用して、病原体感染時のインフラマソーム活性化を調節します。ここでは、ASC遺伝子は、クラスター化された、規則的に間隔を空けた、短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連（Cas）-9テクノロジーを使用して、ウシ乳腺上皮（MAC-T）細胞でノックアウトされました。MAC-T細胞は、ラクトバチルスラムノサスGR-1の有無にかかわらずプレインキュベートされ、大腸菌に曝露されました。ウエスタンブロット分析は、大腸菌感染後のNLRP3およびNLRC4の発現の増加を示しましたが、この増加は、ASCノックアウトに関係なく、L。ラムノサスGR-1とのプレインキュベーションによって弱められました。ウエスタンブロットおよび免疫蛍光分析により、L。ラムノサスGR-1とのプレインキュベーションにより、ASCノックアウトMAC-T細胞でも観察されるように、大腸菌感染後6時間で大腸菌が誘導するカスパーゼ-1の活性化が低下することが明らかになりました。大腸菌が誘導するカスパーゼ-4mRNA発現の増加は、L。ラムノサスGR-1とのプレインキュベーションによって阻害されました。ASCノックアウトは、IL-1βおよびIL-18の産生の増加と、大腸菌感染に関連する細胞ピロトーシスを減少させましたが、完全には防止しませんでしたが、L。ラムノサスGR-1とのプレインキュベーションはこの増加を抑制しました。私たちのデータは、L。ラムノサスGR-1が大腸菌感染時にASC依存性NLRP3およびNLRC4インフラマソームの活性化と下流のIL-1ベータおよびIL-18の産生を抑制することを示しています。L. rhamnosus GR-1は、ASCとは独立して、NLRC4および非標準的なカスパーゼ-4の活性化を部分的に弱めることにより、E。coliによって誘発される細胞の発熱を抑制しました。"]
[14,29892841,"animal","cow","TALENs;","bta-miR-192","Genes & genomics","Selected microRNA-192 mutant indicates association with several function genes in bovine cells.",2018,"40(4):361-371","[Zi C et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",29892841,"10.1007/s13258-017-0635-3 ","MicroRNAs are implicated in many cellular processes such as cell differentiation  and development, tumorigenesis, and immune regulation. In this study, miR192 was  detected using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) when MDBK cells were exposed to Escherichia coli. Cells with malfunction of bta-miR-192 were established using transcription activator-like effector nuclease (TALEN) technology. Finally, bta-miR-192 mutant cells were screened for differentially expressed genes using RNA-sequencing (RNA-seq). The results showed that miR192 significantly decreased in cells exposed to E. coli F18ac and E. coli K88ac. The RNA-seq results showed that 1673 differentially expressed transcripts  were identified; 890 genes were upregulated and 775 genes were downregulated. With the gene ontology enrichment analysis, 431 differentially expressed genes (DEGs) were classified into 937 gene ontology terms. The pathway enrichment analysis showed that 535 genes were involved in 254 pathway terms. Interestingly, most of these DEGs were associated with the pathways in cancers or infectious diseases. When the selected DEGs (n = 162) in these pathways were intersected with 120 differential transcripts, 11 DEGs were identified. Subsequently, several genes associated with regulation, cancers, or viral infections, such as LEF1, AXIN2, MX1, and FCGR2B, were identified among the DEGs using functional analysis. Furthermore, associations between bta-miR-192 and DEGs were detected by intersecting the bta-miR-192's target genes with the DEGs, indicating that three  genes including CBL, DICER1 and TRERF1 were involved in this relationship. These  findings provided useful guidance for investigating the role played by bta-miR-192 in cellular functionality in bovine cells.","cow","マイクロRNAは、細胞の分化と発達、腫瘍形成、免疫調節などの多くの細胞プロセスに関与しています。この研究では、MDBK細胞が大腸菌に曝露されたときに定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を使用してmiR192が検出されました。bta-miR-192の機能不全を伴う細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）技術を使用して確立されました。最後に、bta-miR-192変異細胞を、RNAシーケンシング（RNA-seq）を使用して差次的に発現する遺伝子についてスクリーニングしました。結果は、miR192がE.coliF18acおよびE.coliK88acに曝露された細胞で有意に減少したことを示しました。RNA-seqの結果は、1673個の差次的に発現する転写物が同定されたことを示しました。890個の遺伝子がアップレギュレートされ、775個の遺伝子がダウンレギュレートされました。遺伝子オントロジー濃縮分析により、431個の差次的に発現する遺伝子（DEG）が937個の遺伝子オントロジー用語に分類されました。経路濃縮分析は、535個の遺伝子が254個の経路項に関与していることを示した。興味深いことに、これらのDEGのほとんどは、癌や感染症の経路に関連していた。これらの経路で選択されたDEG（n = 162）が120の異なる転写産物と交差した場合、11のDEGが同定されました。その後、LEF1、AXIN2、MX1、FCGR2Bなど、規制、癌、またはウイルス感染に関連するいくつかの遺伝子が、機能分析を使用してDEG間で特定されました。さらに、bta-miR-192とDEGの関連は、bta-miR-192の標的遺伝子をDEGと交差させることによって検出され、CBL、DICER1、TRERF1を含む3つの遺伝子がこの関係に関与していることを示しています。これらの発見は、ウシ細胞の細胞機能においてbta-miR-192が果たす役割を調査するための有用なガイダンスを提供しました。"]
[15,30078180,"animal","cow","CRISPR;","phosphodiesterase 2A","Journal of cellular physiology","MiR-139 promotes differentiation of bovine skeletal muscle-derived satellite cells by regulating DHFR gene expression.",2018,"234(1):632-641","[Zhou S  et al.]","Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang, China.",30078180,"10.1002/jcp.26817 ","MicroRNAs play an important regulatory role in the proliferation and differentiation of skeletal muscle-derived satellite cells (MDSCs). In particular, miR-139 can inhibit tumor cell proliferation and invasion, and its expression is down-regulated during C2C12 myoblast differentiation. The aim of this study was thus to examine the effect and potential mechanism of miR-139 in bovine MDSCs. The expression of miR-139 was found to be significantly increased during bovine MDSC differentiation by stem-loop reverse transcription-polymerase  chain reaction amplification. Statistical analysis of the myotube fusion rate was done through immunofluorescence detection of desmin, and western blotting was used to measure the change in protein expression of the muscle differentiation marker genes MYOG and MYH3. The results showed that the miR-139 mimic could enhance the differentiation of bovine MDSCs, whereas the inhibitor had the opposite effect. By using the dual-luciferase reporter system, miR-139 was found  to target the 3'-untranslated region of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene and regulate its expression. In addition, the expression of miR-139 was found to  be regulated by its host gene phosphodiesterase 2A (PDE2A) via inhibition of the  latter by CRISPR interference (CRISPRi). Overall, our findings indicate that miR-139 plays an important role in regulating the differentiation of bovine MDSCs.","cow","マイクロRNAは、骨格筋由来の衛星細胞（MDSC）の増殖と分化において重要な調節的役割を果たします。特に、miR-139は腫瘍細胞の増殖と浸潤を阻害する可能性があり、その発現はC2C12筋芽細胞の分化中にダウンレギュレートされます。したがって、この研究の目的は、ウシMDSCにおけるmiR-139の効果と潜在的なメカニズムを調べることでした。miR-139の発現は、ステムループ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応増幅によるウシMDSC分化中に有意に増加することが見出されました。筋管融合率の統計分析は、デスミンの免疫蛍光検出によって行われ、ウエスタンブロッティングを使用して、筋肉分化マーカー遺伝子MYOGおよびMYH3のタンパク質発現の変化を測定しました。結果は、miR-139模倣物がウシMDSCの分化を増強できるのに対し、阻害剤は反対の効果を有することを示した。デュアルルシフェラーゼレポーターシステムを使用することにより、miR-139はジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子の3 '非翻訳領域を標的とし、その発現を調節することがわかりました。さらに、miR-139の発現は、CRISPR干渉（CRISPRi）による後者の阻害を介してその宿主遺伝子ホスホジエステラーゼ2A（PDE2A）によって調節されることが見出されました。全体として、我々の発見は、miR-139がウシMDSCの分化を調節する上で重要な役割を果たすことを示しています。"]
[16,29483258,"animal","cow","CRISPR;Cas9;","OCT4","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","OCT4/POU5F1 is required for NANOG expression in bovine blastocysts.",2018,"115(11):2770-2775","[Simmet K  et al.]","Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen, Munich, Germany.",29483258,"10.1073/pnas.1718833115 ","Mammalian preimplantation development involves two lineage specifications: first, the CDX2-expressing trophectoderm (TE) and a pluripotent inner cell mass (ICM) are separated during blastocyst formation. Second, the pluripotent epiblast (EPI; expressing NANOG) and the differentiated primitive endoderm (PrE; expressing GATA6) diverge within the ICM. Studies in mice revealed that OCT4/POU5F1 is at the center of a pluripotency regulatory network. To study the role of OCT4 in bovine preimplantation development, we generated OCT4 knockout (KO) fibroblasts by CRISPR-Cas9 and produced embryos by somatic cell nuclear transfer (SCNT). SCNT embryos from nontransfected fibroblasts and embryos produced by in vitro fertilization served as controls. In OCT4 KO morulae (day 5), approximately 70% of the nuclei were OCT4 positive, indicating that maternal OCT4 mRNA partially maintains OCT4 protein expression during early development. In contrast, OCT4 KO  blastocysts (day 7) lacked OCT4 protein entirely. CDX2 was detected only in TE cells; OCT4 is thus not required to suppress CDX2 in the ICM. Control blastocysts showed a typical salt-and-pepper distribution of NANOG- and GATA6-positive cells  in the ICM. In contrast, NANOG was absent or very faint in the ICM of OCT4 KO blastocysts, and no cells expressing exclusively NANOG were observed. This mimics findings in OCT4-deficient human blastocysts but is in sharp contrast to Oct4-null mouse blastocysts, where NANOG persists and PrE development fails. Our  study supports bovine embryogenesis as a model for early human development and exemplifies a general strategy for studying the roles of specific genes in embryos of domestic species.","cow","哺乳類の着床前診断には、2つの系統仕様が含まれます。1つは、CDX2を発現する栄養外胚葉（TE）と多能性内部細胞塊（ICM）が胚盤胞形成中に分離されることです。第二に、多能性エピブラスト（EPI; NANOGを発現）と分化した原始内胚葉（PrE; GATA6を発現）はICM内で分岐します。マウスでの研究により、OCT4 / POU5F1が多能性調節ネットワークの中心にあることが明らかになりました。ウシの移植前の発達におけるOCT4の役割を研究するために、CRISPR-Cas9によってOCT4ノックアウト（KO）線維芽細胞を生成し、体細胞核移植（SCNT）によって胚を生成しました。トランスフェクトされていない線維芽細胞からのSCNT胚および体外受精によって生成された胚が対照として機能した。OCT4 KO桑実胚（5日目）では、核の約70％がOCT4陽性であり、母体のOCT4mRNAが初期発生時にOCT4タンパク質の発現を部分的に維持していることを示しています。対照的に、OCT4 KO胚盤胞（7日目）はOCT4タンパク質を完全に欠いていました。CDX2はTE細胞でのみ検出されました。したがって、OCT4はICMでCDX2を抑制する必要はありません。対照胚盤胞は、ICMにおけるNANOGおよびGATA6陽性細胞の典型的な塩コショウ分布を示した。対照的に、NANOGはOCT4 KO胚盤胞のICMに存在しないか、非常にかすかであり、NANOGのみを発現する細胞は観察されませんでした。これは、OCT4欠損のヒト芽嚢胞の所見を模倣していますが、NANOGが持続し、PrEの発生が失敗するOct4ヌルマウス芽嚢胞とは対照的です。私たちの研究は、初期の人間の発達のモデルとしてウシの胚発生をサポートし、家畜種の胚における特定の遺伝子の役割を研究するための一般的な戦略を例示しています。"]
[17,30337546,"animal","cow","ZFN;","beta-lactoglobulin","Scientific reports","Production of hypoallergenic milk from DNA-free beta-lactoglobulin (BLG) gene knockout cow using zinc-finger nucleases mRNA.",2018,"8(1):15430","[Sun Z et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30337546,"10.1038/s41598-018-32024-x ","The whey protein beta-lactoglobulin (BLG) is a major milk allergen which is absent in human milk. Here, we for the first time generated DNA-free BLG bi-allelic knockout cow by zinc-finger nuclease (ZFNs) mRNA and produced BLG-free milk. According to the allergenicity evaluation of BLG-free milk, we found it can trigger lower allergic reaction of Balb/c mice including the rectal temperature drop and the allergen-specific immunoglobulin IgE production; BLG free-milk was easily digested by pepsin at 2 min, while BLG in control milk was still not completely digested after 60 min, and the binding of IgE from cow's milk allergy  (CMA) patients to BLG free-milk was significantly lower than that to the control  milk. Meanwhile, the genome sequencing revealed that our animal is free of off-target events. Importantly, editing animal genomes without introducing foreign DNA into cells may alleviate regulatory concerns related to foods produced by genome edited animals. Finally, the ZFNs-mediated targeting in cow could be transmitted through the germline by breeding. These findings will open up unlimited possibilities of modifying milk composition to make it more suitable for human health and also improve the functional properties of milk.","cow","ホエイプロテインベータラクトグロブリン（BLG）は、母乳には含まれていない主要な牛乳アレルゲンです。ここでは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）mRNAによって初めてDNAフリーのBLGバイアレルノックアウト牛を生成し、BLGフリーの牛乳を生産しました。BLGを含まない牛乳のアレルギー誘発性評価によると、直腸温の低下やアレルゲン特異的免疫グロブリンIgE産生など、Balb / cマウスのアレルギー反応を低下させる可能性があることがわかりました。BLGフリーミルクは2分でペプシンによって容易に消化されましたが、コントロールミルクのBLGは60分後も完全に消化されておらず、牛乳アレルギー（CMA）患者からのIgEのBLGフリーミルクへの結合はそれよりも有意に低かったコントロールミルクに。一方、ゲノム配列決定により、私たちの動物にはオフターゲットイベントがないことが明らかになりました。重要なことに、細胞に外来DNAを導入せずに動物のゲノムを編集すると、ゲノム編集された動物が生産する食品に関連する規制上の懸念が緩和される可能性があります。最後に、牛におけるZFNを介したターゲティングは、繁殖によって生殖細胞系列を介して伝達される可能性があります。これらの発見は、牛乳の組成を変更して人間の健康により適したものにし、牛乳の機能特性を改善する可能性を無限に広げます。"]
[18,29991797,"animal","cow","TALENs;","Rosa26","Scientific reports","Efficient targeted integration into the bovine Rosa26 locus using TALENs.",2018,"8(1):10385","[Wang M et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29991797,"10.1038/s41598-018-28502-x ","The genetic modification of cattle has many agricultural and biomedical applications. However, random integration often results in the unstable expression of transgenes and unpredictable phenotypes. Targeting genes to the \"safe locus\" and stably expressing foreign genes at a high level are desirable methods for overcoming these hurdles. The Rosa26 locus has been widely used to produce genetically modified animals in some species expressing transgenes at high and consistent levels. For the first time, we identified a bovine orthologue of the mouse Rosa26 locus through a genomic sequence homology analysis. According to 5' rapid-amplification of cDNA ends (5'RACE), 3' rapid-amplification of cDNA ends (3'RACE), reverse transcription PCR (RT-PCR) and quantitative PCR (Q-PCR) experiments, this locus encodes a long noncoding RNA (lncRNA) comprising two exons that is expressed ubiquitously and stably in different tissues. The bovine  Rosa26 (bRosa26) locus appears to be highly amenable to transcription activator-like effector nucleases (TALENs)-mediated knock-in, and ubiquitous expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the bRosa26 locus was observed in various stages, including cells, embryos, fetus and cattle. Finally, we created a valuable master bRosa26-EGFP fetal fibroblast cell line in  which any gene of interest can be efficiently introduced and stably expressed using recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). The new tools described here will be useful for a variety of studies using cattle.","cow","牛の遺伝子組み換えには、多くの農業および生物医学的用途があります。ただし、ランダムな統合は、多くの場合、導入遺伝子の不安定な発現と予測できない表現型をもたらします。これらのハードルを克服するためには、遺伝子を「安全な遺伝子座」にターゲティングし、外来遺伝子を高レベルで安定して発現させることが望ましい方法です。Rosa26遺伝子座は、高い一貫したレベルで導入遺伝子を発現するいくつかの種で遺伝子改変動物を生産するために広く使用されています。初めて、ゲノム配列相同性分析を通じて、マウスRosa26遺伝子座のウシオルソログを同定しました。cDNA末端の5 '急速増幅（5'RACE）、cDNA末端の3'急速増幅（3'RACE）、逆転写PCR（RT-PCR）および定量PCR（Q-PCR）実験によると、この遺伝子座異なる組織で遍在的かつ安定して発現される2つのエキソンを含む長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）をコードします。ウシRosa26（bRosa26）遺伝子座は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を介したノックインに非常に敏感であるようであり、bRosa26遺伝子座に挿入された強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）の遍在的な発現がさまざまな段階で観察されました。細胞、胚、胎児、牛を含みます。最後に、リコンビナーゼを介したカセット交換（RMCE）を使用して、目的の遺伝子を効率的に導入し、安定して発現させることができる、貴重なマスターbRosa26-EGFP胎児線維芽細胞株を作成しました。ここで説明する新しいツールは、牛を使用したさまざまな研究に役立ちます。"]
[19,29773834,"animal","cow","CRISPR;Cas9;","POU5F1","Scientific reports","Embryonic POU5F1 is Required for Expanded Bovine Blastocyst Formation.",2018,"8(1):7753","[Daigneault BW et al.]","Michigan State University, East-Lansing, MI,  USA.",29773834,"10.1038/s41598-018-25964-x ","POU5F1 is a transcription factor and master regulator of cell pluripotency with indispensable roles in early embryo development and cell lineage specification. The role of embryonic POU5F1 in blastocyst formation and cell lineage specification differs between mammalian species but remains completely unknown in cattle. The CRISPR/Cas9 system was utilized for targeted disruption of the POU5F1 gene by direct injection into zygotes. Disruption of the bovine POU5F1 locus prevented blastocyst formation and was associated with embryonic arrest at the morula stage. POU5F1 knockout morulas developed at a similar rate as control embryos and presented a similar number of blastomeres by day 5 of development. Initiation of SOX2 expression by day 5 of development was not affected by lack of POU5F1. On the other hand, CDX2 expression was aberrant in embryos lacking POU5F1. Notably, the phenotype observed in bovine POU5F1 knockout embryos reveals conserved functions associated with loss of human embryonic POU5F1 that differ from Pou5f1- null mice. The similarity observed in transcriptional regulation of  early embryo development between cattle and humans combined with highly efficient gene editing techniques make the bovine a valuable model for human embryo biology with expanded applications in agriculture and assisted reproductive technologies.","cow","POU5F1は、転写因子であり、細胞の多能性のマスターレギュレーターであり、初期胚発生と細胞系統の特定に不可欠な役割を果たします。胚盤胞形成および細胞系統の特定における胚性POU5F1の役割は、哺乳類の種間で異なりますが、ウシでは完全に不明なままです。CRISPR / Cas9システムは、接合子への直接注入によるPOU5F1遺伝子の標的破壊に利用されました。ウシPOU5F1遺伝子座の破壊は胚盤胞形成を防ぎ、桑実胚段階での胚停止と関連していた。POU5F1ノックアウト桑実胚は、対照胚と同様の速度で発生し、発生5日目までに同様の数の割球を示しました。開発の5日目までのSOX2発現の開始は、POU5F1の欠如による影響を受けませんでした。一方、CDX2の発現はPOU5F1を欠く胚では異常でした。特に、ウシPOU5F1ノックアウト胚で観察された表現型は、Pou5f1-nullマウスとは異なるヒト胚性POU5F1の喪失に関連する保存された機能を明らかにします。牛とヒトの間の初期胚発生の転写調節で観察された類似性と、非常に効率的な遺伝子編集技術を組み合わせることで、ウシは農業や生殖補助医療での応用が拡大したヒト胚生物学の貴重なモデルになります。"]
[20,29769555,"animal","cow","TALENs;","beta-lactoglobulin","Scientific reports","Cattle with a precise, zygote-mediated deletion safely eliminate the major milk allergen beta-lactoglobulin.",2018,"8(1):7661","[Wei J et al.]","AgResearch, Hamilton, New Zealand.",29769555,"10.1038/s41598-018-25654-8 ","We applied precise zygote-mediated genome editing to eliminate beta-lactoglobulin (BLG), a major allergen in cows' milk. To efficiently generate LGB knockout cows, biopsied embryos were screened to transfer only appropriately modified embryos. Transfer of 13 pre-selected embryos into surrogate cows resulted in the birth of  three calves, one dying shortly after birth. Deep sequencing results confirmed conversion of the genotype from wild type to the edited nine bp deletion by more  than 97% in the two male calves. The third calf, a healthy female, had in addition to the expected nine bp deletion (81%), alleles with an in frame 21 bp deletion (<17%) at the target site. While her milk was free of any mature BLG, we detected low levels of a BLG variant derived from the minor deletion allele. This confirmed that the nine bp deletion genotype completely knocks out production of  BLG. In addition, we showed that the LGB knockout animals are free of any TALEN-mediated off-target mutations or vector integration events using an unbiased whole genome analysis. Our study demonstrates the feasibility of generating precisely biallelically edited cattle by zygote-mediated editing for the safe production of hypoallergenic milk.","cow","牛乳中の主要なアレルゲンであるベータラクトグロブリン（BLG）を排除するために、正確な接合子を介したゲノム編集を適用しました。LGBノックアウト牛を効率的に生成するために、生検した胚をスクリーニングして、適切に改変された胚のみを移植しました。事前に選択された13個の胚を代理母牛に移植すると、3頭の子牛が生まれ、1頭は出生直後に死亡しました。ディープシーケンスの結果により、2頭の雄の子牛で野生型から編集された9 bpの欠失への遺伝子型の変換が97％以上確認されました。健康な雌である3番目の子牛は、予想される9 bpの欠失（81％）に加えて、標的部位に21 bpのインフレーム欠失（<17％）を持つ対立遺伝子を持っていました。彼女の牛乳には成熟したBLGは含まれていませんでしたが、マイナーな欠失対立遺伝子に由来するBLG変異体が低レベルで検出されました。これにより、9bpの欠失遺伝子型がBLGの産生を完全にノックアウトすることが確認されました。さらに、偏りのない全ゲノム解析を使用して、LGBノックアウト動物にTALENを介したオフターゲット変異やベクター統合イベントがないことを示しました。私たちの研究は、低刺激性の牛乳を安全に生産するために、接合子を介した編集によって正確に二対立遺伝子的に編集された牛を生成する可能性を示しています。"]
[21,30075414,"animal","cow","TALENs","beta-glycosidase (LacS)","Theriogenology","Production of microhomologous-mediated site-specific integrated LacS gene cow using TALENs.",2018,"119:282-288","[Su X et al.]","Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.",30075414,"10.1016/j.theriogenology.2018.07.011 ","Gene editing tools (Zinc-Finger Nucleases, ZFN; Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALEN; and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic  Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9, CRISPR-Cas9) provide us with a powerful means of performing genetic engineering procedures. A combinational approach that utilizes both somatic cell nuclear transfer (SCNT) and somatic cell gene editing facilitates the generation of genetically engineered animals. However, the associated research has utilized markers and/or selected genes, which constitute a potential threat to biosafety. Microhomologous-mediated end-joining (MMEJ) has showed the utilization of micro-homologous arms (5-25 bp)  can mediate exogenous gene insertion. Dairy milk is a major source of nutrition worldwide. However, most people are not capable of optimally utilizing the nutrition in milk because of lactose intolerance. Sulfolobus solfataricus beta-glycosidase (LacS) is a lactase derived from the extreme thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Our finally aim was to site-specific integrated LacS gene into cow's genome through TALEN-mediated MMEJ and produce low-lactose cow. Firstly, we constructed TALENs vectors which target to the cow's beta-casein locus and LacS gene expression vector which contain TALEN reorganization sequence and micro-homologous arms. Then we co-transfected these vectors into fetal derived skin fibroblasts and cultured as monoclone. Positive cell clones were screened using 3' junction PCR amplification and sequencing analysis. The positive cells were used as donors for SCNT and embryo transfer (ET). Lastly, we  detected the genotype through PCR of blood genomic DNA. This resulted in a LacS knock-in rate of 0.8% in TALEN-treated cattle fetal fibroblasts. The blastocyst rate of SCNT embryo was 27%. The 3 months pregnancy rate was 20%. Finally, we obtained 1 newborn cow (5%) and verified its genotype. We obtained 1 site-specific marker-free LacS transgenic cow. It provides a basis to solve lactose intolerance by gene engineering breeding. This study also provides us with a new strategy to facilitate gene knock-ins in livestock using techniques that exhibit improved biosafety and intuitive methodologies.","cow","遺伝子編集ツール（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ZFN、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、TALEN、およびクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連（Cas）9、CRISPR-Cas9）は、強力な手段を提供します。遺伝子工学手順の実行。体細胞核移植（SCNT）と体細胞遺伝子編集の両方を利用する組み合わせアプローチは、遺伝子改変動物の生成を容易にします。しかし、関連する研究では、バイオセーフティに対する潜在的な脅威を構成するマーカーおよび/または選択された遺伝子が利用されています。マイクロホモログを介した末端結合（MMEJ）は、マイクロホモログアーム（5〜25 bp）の利用が外因性遺伝子の挿入を仲介できることを示しています。乳製品は世界中の主要な栄養源です。しかし、ほとんどの人は乳糖不耐症のために牛乳の栄養を最適に利用することができません。Sulfolobus solfataricusベータ-グリコシダーゼ（LacS）は、極度の好熱性古細菌Sulfolobussolfataricusに由来するラクターゼです。私たちの最終的な目的は、TALENを介したMMEJを介して、部位特異的に統合されたLacS遺伝子を牛のゲノムに組み込み、低乳糖牛を生産することでした。まず、牛のベータカゼイン遺伝子座を標的とするTALENベクターと、TALEN再編成配列とマイクロホモログアームを含むLacS遺伝子発現ベクターを構築しました。次に、これらのベクターを胎児由来の皮膚線維芽細胞にコトランスフェクトし、モノクローナルとして培養しました。陽性細胞クローンは、3 'ジャンクションPCR増幅およびシーケンシング分析を使用してスクリーニングされました。陽性細胞は、SCNTおよび胚移植（ET）のドナーとして使用されました。最後に、血液ゲノムDNAのPCRにより遺伝子型を検出しました。これにより、TALENで処理されたウシ胎児線維芽細胞でのLacSノックイン率は0.8％になりました。体細胞核移植胚の胚盤胞率は27％でした。3ヶ月の妊娠率は20％でした。最後に、1頭の新生牛（5％）を取得し、その遺伝子型を確認しました。部位特異的なマーカーフリーのLacSトランスジェニック牛を1頭入手しました。それは、遺伝子工学育種によってラクトース不耐性を解決するための基礎を提供します。この研究はまた、改善された生物学的安全性と直感的な方法論を示す技術を使用して、家畜の遺伝子ノックインを促進するための新しい戦略を提供します。"]
[22,29669988,"animal","cow (Japanese Black cattle)","CRISPR;Cas9;","isoleucyl-tRNA synthetase","Biomedical research (Tokyo, Japan)","Establishment of protocol for preparation of gene-edited bovine ear-derived fibroblasts for somatic cell nuclear transplantation.",2018,"39(2):95-104","[Ishino T et al.]","Rakuno Gakuen University, Japan.",29669988,"10.2220/biomedres.39.95 ","Recently, gene-editing using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated protein 9 (Cas9) technique has attempted to utilize fibroblasts of livestock animals for somatic cell nuclear transfer. In this study, we establish the procedure for preparing skin fibroblast clones whose genes were edited by the CRISPR/Cas9 technique. After isolating fibroblasts from earlobes of Japanese Black cattle, subsequent collagenase-digestion and extensive wash procedures enabled us to avoid contamination of fungi. Electroporation using NEPA21, rather than lipofection using commercially available liposome reagents, allowed us to perform more efficient transfection of plasmid constructs. Although bovine ear-derived fibroblasts were not able to proliferate in single cell cultures in Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum, supplementation with insulin-transferrin-selenium mixture, human recombinant epidermal growth factor,  or human recombinant basic fibroblast growth factor promoted proliferation of the cells, even in a single cell culture. Taking advantage of our established protocol, we eventually obtained eight ear-derived fibroblast clones with a recessive mutation in the isoleucyl-tRNA synthetase gene corrected by the CRISPR/Cas9 technique.","cow","最近、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）技術を使用した遺伝子編集により、家畜の線維芽細胞を体細胞核移植に利用しようと試みました。この研究では、CRISPR / Cas9技術によって遺伝子が編集された皮膚線維芽細胞クローンを調製するための手順を確立します。黒毛和種の耳たぶから線維芽細胞を分離した後、その後のコラゲナーゼ消化と広範な洗浄手順により、真菌の汚染を回避することができました。市販のリポソーム試薬を使用したリポフェクションではなく、NEPA21を使用したエレクトロポレーションにより、プラスミドコンストラクトのより効率的なトランスフェクションを実行できました。ウシの耳由来の線維芽細胞は、10％の子牛の胎児血清を含むダルベッコの改変イーグル培地での単一細胞培養では増殖できなかったが、インスリン-トランスフェリン-セレン混合物、ヒト組換え表皮増殖因子、またはヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子の補充が促進された単一の細胞培養においてさえ、細胞の増殖。確立されたプロトコルを利用して、最終的にCRISPR / Cas9技術によって修正されたイソロイシルtRNAシンテターゼ遺伝子の劣性突然変異を伴う8つの耳由来線維芽細胞クローンを取得しました。"]
[23,29556895,"animal","Debao pig; swamp buffalo","CRISPR;Cas9;","growth differentiation factor 8 (GDF8)","In vitro cellular & developmental biology. Animal","Efficient genome editing in cultured cells and embryos of Debao pig and swamp buffalo using the CRISPR/Cas9 system.",2018,"54(5):375-383","[Su X et al.]","Guangxi University, Nanning, China.",29556895,"10.1007/s11626-018-0236-8 ","Myostatin (MSTN), a protein encoded by growth differentiation factor 8 (GDF8), is primarily expressed in skeletal muscle and negatively regulates the development and regeneration of muscle. Accordingly, myostatin-deficient animals exhibit a double-muscling phenotype. The CRISPR/Cas9 system has proven to be an efficient genome-editing tool and has been applied to gene modification in cells from many  model organisms such as Drosophila melanogaster, zebrafish, mouse, rat, sheep, and human. Here, we edited the GDF8 gene in fibroblasts and embryos of Debao pig  and swamp buffalo using the CRISPR/Cas9 system. The CRISPR/Cas9-mediated mutation efficiency in fibroblasts was as high as 87.5% in pig and 78.9% in buffalo. We then obtained single-cell clones with mutations at the specific sites of the GDF8 gene by screening with G418 in fibroblasts of pig and buffalo. In addition, the frequencies of Cas9/gRNA-mediated mutations were at 36 and 25% in the intracytoplasmic sperm injection embryos of pig and in vitro fertilization embryos of buffalo, respectively. Our work demonstrates that the Cas9/gRNA system is a highly efficient and fast tool for genome editing in cultured cells and embryos of Debao pig and swamp buffalo. These results can be helpful for the establishment of a new animal strain that can generate more meat.","cow; pig","ミオスタチン（MSTN）は、成長分化因子8（GDF8）によってコードされるタンパク質であり、主に骨格筋で発現し、筋肉の発達と再生を負に調節します。したがって、ミオスタチン欠損動物は二重筋肉表現型を示します。CRISPR / Cas9システムは、効率的なゲノム編集ツールであることが証明されており、キイロショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ヒツジ、ヒトなどの多くのモデル生物の細胞における遺伝子改変に適用されています。ここでは、CRISPR / Cas9システムを使用して、Debao豚と沼地の水牛の線維芽細胞と胚のGDF8遺伝子を編集しました。線維芽細胞におけるCRISPR / Cas9を介した突然変異効率は、ブタで87.5％、バッファローで78.9％と高かった。次に、ブタとバッファローの線維芽細胞でG418を用いてスクリーニングすることにより、GDF8遺伝子の特定の部位に変異を持つ単一細胞クローンを取得しました。さらに、Cas9 / gRNAを介した突然変異の頻度は、ブタの卵細胞質内精子注入胚とバッファローの体外受精胚でそれぞれ36％と25％でした。私たちの研究は、Cas9 / gRNAシステムが、Debao豚と沼地の水牛の培養細胞と胚におけるゲノム編集のための非常に効率的で高速なツールであることを示しています。これらの結果は、より多くの肉を生産できる新しい動物系統の確立に役立つ可能性があります。"]
[24,29725264,"animal","Cashmere Goat","CRISPR;Cas9;","EDAR","International journal of biological sciences","Generation of Cashmere Goats Carrying an EDAR Gene Mutant Using CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing.",2018,"14(4):427-436","[Hao F et al.]","Inner Mongolia University, Hohhot, China.",29725264,"10.7150/ijbs.23890 ","In recent years, while the use of the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) (CRISPR-Cas9) system for targeted genome editing has become a research hotspot, it has, to date, not proved adequate for genome editing in large mammals, such as goats. In  this study, two opposite single-guide RNAs (sgRNAs) were designed for complete EDAR gene targeting in Cashmere goats, and co-transfected with a plasmid encoding Cas9 into goat fibroblasts. Among the 89 cell lines obtained through the cultivation of clonal cell lines, 62 were positive for EDAR gene targeting. Nine  types of mutations were identified by sequencing analysis, and the mutation efficiency was 69.7%. Using one of these cell lines, EDAR gene-targeted Cashmere  goat embryos were prepared by somatic cell cloning. Developed embryos were transferred to 79 Cashmere goat recipients, and, after a gestation period of five months six male EDAR gene-targeted Cashmere goats were born. Although only two of these goats survived, they had abnormal primary hair follicles and no hair on the top of their heads, which are the distinctive features of the EDAR gene-targeted  Cashmere goats. Thus, this study provides a valuable animal model for future studies on EDAR gene-related phenotypes and hair follicle growth and development  and shows that the CRISPR-Cas9 system can be used to edit genes in large mammals.","goat","近年、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-CRISPR関連タンパク質9（Cas9）（CRISPR-Cas9）システムをターゲットゲノム編集に使用することが研究のホットスポットになっていますが、これまでのところ、ヤギなどの大型哺乳類のゲノム編集に適していることが証明されました。この研究では、2つの反対のシングルガイドRNA（sgRNA）が、カシミアヤギの完全なEDAR遺伝子ターゲティング用に設計され、Cas9をコードするプラスミドでヤギ線維芽細胞に同時トランスフェクトされました。クローン細胞株の培養により得られた89の細胞株のうち、62がEDAR遺伝子ターゲティングに陽性でした。シーケンシング解析により9種類の変異が同定され、変異効率は69.7％でした。これらの細胞株の1つを使用して、EDAR遺伝子を標的としたカシミアヤギ胚を体細胞クローニングによって調製しました。発生した胚を79頭のカシミヤヤギレシピエントに移植し、5ヶ月の妊娠期間の後、6頭の雄EDAR遺伝子標的カシミヤヤギが生まれました。これらのヤギのうち2頭だけが生き残ったが、EDAR遺伝子を標的としたカシミヤヤギの特徴である異常な一次毛包があり、頭頂部に毛がなかった。したがって、この研究は、EDAR遺伝子関連の表現型と毛包の成長と発達に関する将来の研究のための貴重な動物モデルを提供し、CRISPR-Cas9システムを使用して大型哺乳類の遺伝子を編集できることを示しています。"]
[25,28662369,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","retinoic acid-inducible gene-1","Animal biotechnology","Generation of Genomic Deletions (of Rig-I GENE) in Goat Primary Cell Culture Using CRISPR/CAS9 Method.",2018,"29(2):142-152","[Malpotra S et al.]","National Dairy Research Institute , Karnal , Haryana , India.",28662369,"10.1080/10495398.2017.1331915 ","CRISPR/Cas9 system is a natural immune system in prokaryotes protecting them from infectious viral or plasmid DNA invading the cells. This RNA-guided system can act as powerful tool for introducing genomic alterations in eukaryotic cells with high efficiency. In the present study, Rig-Igene is taken as model gene to study  the efficiency of CRISPR/Cas9 system induced gene deletion in primary fibroblast  cell culture. Rig-I(retinoic acid-inducible gene-1) is involved in regulating immune response in mammals. In this study, we optimized the CRISPR/Cas9 method for knocking out Rig-Igene in Goat primary fibroblasts by using a NHEJ pathway. Cells were screened for inactivation of the Rig-Igene and two positive clones were found out of thirty colonies screened. Thus, cells containing Rig-Igene inactivation could be achieved by CRISPR/Cas9 in goat fibroblast cells.","goat","CRISPR / Cas9システムは、原核生物の自然な免疫システムであり、細胞に侵入する感染性のウイルスまたはプラスミドDNAから原核生物を保護します。このRNA誘導システムは、真核細胞に高効率でゲノム変化を導入するための強力なツールとして機能します。本研究では、Rig-Igeneをモデル遺伝子として採用し、初代線維芽細胞培養におけるCRISPR / Cas9システムによる遺伝子欠失の効率を研究します。Rig-I（レチノイン酸誘導性遺伝子-1）は、哺乳類の免疫応答の調節に関与しています。この研究では、NHEJ経路を使用して、ヤギ初代線維芽細胞のRig-IgeneをノックアウトするためのCRISPR / Cas9メソッドを最適化しました。Rig-Igeneの不活化について細胞をスクリーニングし、スクリーニングされた30個のコロニーから2つの陽性クローンが見つかりました。したがって、Rig-Igene不活化を含む細胞は、ヤギ線維芽細胞のCRISPR / Cas9によって達成できます。"]
[26,29446146,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","MSTN","Animal genetics","CRISPR/Cas9-mediated MSTN disruption and heritable mutagenesis in goats causes increased body mass.",2018,"49(1):43-51","[Wang X et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China.",29446146,"10.1111/age.12626 ","Genetic engineering in livestock has been greatly enhanced through the use of artificial programmed nucleases such as the recently emerged clustered regularly  interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) system. We recently reported our successful application of the CRISPR/Cas9 system to engineer the goat genome through micro-injection of Cas9 mRNA and sgRNAs targeting MSTN and FGF5 in goat embryos. The phenotypes induced by edited loss-of-function mutations of MSTN remain to be evaluated extensively. We demonstrate the utility of this approach by disrupting MSTN, resulting in enhanced body weight and larger muscle fiber size in Cas9-mediated gene-modified  goats. The effects of genome modifications were further characterized by H&E staining, quantitative PCR, Western blotting and immunofluorescence staining. Morphological and genetic analyses indicated the occurrence of phenotypic and genotypic modifications. We further provide sufficient evidence, including breeding data, to demonstrate the transmission of the knockout alleles through the germline. By phenotypic and genotypic characterization, we demonstrated the merit of using the CRISPR/Cas9 approach for establishing genetically modified livestock with an enhanced production trait.","goat","家畜の遺伝子工学は、最近出現したクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連9（Cas9）システムなどの人工的にプログラムされたヌクレアーゼの使用によって大幅に強化されました。最近、CRISPR / Cas9システムを適用して、ヤギ胚のMSTNとFGF5を標的とするCas9mRNAとsgRNAをマイクロインジェクションすることでヤギゲノムを操作することに成功したことを報告しました。MSTNの編集された機能喪失型変異によって誘発される表現型は、まだ広範囲に評価されていません。MSTNを破壊することにより、このアプローチの有用性を示し、Cas9を介した遺伝子改変ヤギの体重を増やし、筋線維のサイズを大きくします。ゲノム修飾の効果は、H＆E染色、定量P​​CR、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光染色によってさらに特徴づけられました。形態学的および遺伝的分析は、表現型および遺伝子型の改変の発生を示した。さらに、生殖細胞系列を介したノックアウト対立遺伝子の伝達を実証するために、繁殖データを含む十分な証拠を提供します。表現型および遺伝子型の特性評価により、CRISPR / Cas9アプローチを使用して、生産特性が強化された遺伝子改変家畜を樹立するメリットを実証しました。"]
[27,30201688,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","myostatin","Bioscience reports","Use of CRISPR/Cas9 technology efficiently targetted goat myostatin through zygotes microinjection resulting in double-muscled phenotype in goats.",2018,"38(6)","[He Z et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu, China.",30201688,"10.1042/BSR20180742 ","Myostatin gene (MSTN) can inhibit the proliferation of myoblast, which in turn promotes muscle growth and inhibits adipocyte differentiation in livestock. MSTN  mutation may lead to muscle hypertrophy or double-muscled (DM) phenotype. MSTN mutation animal, such as sheep, dog, and rabbit have been generated through CRISPR/Cas9 technology. However, goats with promising MSTN mutation have not been generated. We designed two sgRNAs loci targetting exon3 of MSTN gene to destroy the MSTN cysteines knots. We got seven goats from seven recipients, in which six  were MSTN knocked-out (KO) goats, with a mutation rate of 85.7%. Destroyed cysteine knots caused MSTN structure inactivation. The average body weight gain (BWG) per day of MSTN KO goats was significantly higher than that of wild-type (WT) goats. MSTN KO goats showed abnormal sugar, fat, and protein metabolism compared with wild-type controls (MSTN(+/+)). Inheritance of mutations was observed in offspring of MSTN KO goats by PCR analysis.","goat","ミオスタチン遺伝子（MSTN）は筋芽細胞の増殖を阻害し、それが次に筋肉の成長を促進し、家畜の脂肪細胞の分化を阻害します。MSTN変異は、筋肉肥大または二重筋肉（DM）表現型につながる可能性があります。羊、犬、ウサギなどのMSTN変異動物は、CRISPR / Cas9テクノロジーによって生成されています。ただし、有望なMSTN変異を持つヤギは生成されていません。MSTNシステインノットを破壊するためにMSTN遺伝子のexon3を標的とする2つのsgRNA遺伝子座を設計しました。7頭のレシピエントから7頭のヤギを入手し、そのうち6頭はMSTNノックアウト（KO）ヤギで、突然変異率は85.7％でした。破壊されたシステインノットはMSTN構造の不活性化を引き起こしました。MSTN KOヤギの1日あたりの平均体重増加（BWG）は、野生型（WT）ヤギのそれよりも有意に高かった。MSTN KOヤギは、野生型コントロール（MSTN（+ / +））と比較して、異常な糖、脂肪、およびタンパク質代謝を示しました。PCR分析により、MSTNKOヤギの子孫に突然変異の遺伝が観察された。"]
[28,29802684,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","myostatin; fat-1","FEBS journal","CRISPR/Cas9-mediated specific integration of fat-1 at the goat MSTN locus.",2018,"285(15):2828-2839","[Zhang J et al.]","Inner Mongolia University, Hohhot, China.",29802684,"10.1111/febs.14520 ","Recent advances in understanding the CRISPR/Cas9 system have provided a precise and versatile approach for genome editing in various species. However, no study has reported simultaneous knockout of endogenous genes and site-specific knockin  of exogenous genes in large animal models. Using the CRISPR/Cas9 system, this study specifically inserted the fat-1 gene into the goat MSTN locus, thereby achieving simultaneous fat-1 insertion and MSTN mutation. We introduced the Cas9, MSTN knockout small guide RNA and fat-1 knockin vectors into goat fetal fibroblasts by electroporation, and obtained a total of 156 positive clonal cell  lines. PCR and sequencing were performed for identification. Of the 156 clonal strains, 40 (25.6%) had simultaneous MSTN knockout and fat-1 insertion at the MSTN locus without drug selection, and 55 (35.25%) and 101 (67.3%) had MSTN mutations and fat-1 insertions, respectively. We generated a site-specific knockin Arbas cashmere goat model using a combination of CRISPR/Cas9 and somatic  cell nuclear transfer for the first time. For biosafety, we mainly focused on unmarked and non-resistant gene screening, and point-specific gene editing. The results showed that simultaneous editing of the two genes (simultaneous knockout  and knockin) was achieved in large animals, demonstrating that the CRISPR/Cas9 system has the potential to become an important and applicable gene engineering tool in safe animal breeding.","goat","CRISPR / Cas9システムの理解における最近の進歩により、さまざまな種のゲノム編集に正確で用途の広いアプローチが提供されています。しかし、大型動物モデルにおける内因性遺伝子の同時ノックアウトと外因性遺伝子の部位特異的ノックインを報告した研究はありません。この研究では、CRISPR / Cas9システムを使用して、fat-1遺伝子をヤギのMSTN遺伝子座に特異的に挿入し、それによってfat-1の挿入とMSTNの変異を同時に達成しました。エレクトロポレーションにより、Cas9、MSTNノックアウトスモールガイドRNAおよびfat-1ノックインベクターをヤギ胎児線維芽細胞に導入し、合計156の陽性クローン細胞株を取得しました。同定のためにPCRと配列決定を行った。156のクローン株のうち、40（25.6％）は薬物選択なしでMSTN遺伝子座に同時にMSTNノックアウトとfat-1挿入があり、55（35.25％）と101（67.3％）はそれぞれMSTN変異とfat-1挿入がありました。 。CRISPR / Cas9と体細胞核移植の組み合わせを使用して、サイト固有のノックインArbasカシミヤヤギモデルを初めて生成しました。バイオセーフティについては、主にマークのない非耐性の遺伝子スクリーニングとポイント固有の遺伝子編集に焦点を当てました。結果は、2つの遺伝子の同時編集（ノックアウトとノックインの同時）が大型動物で達成されたことを示し、CRISPR / Cas9システムが安全な動物繁殖における重要かつ適用可能な遺伝子工学ツールになる可能性があることを示しています。"]
[29,30356875,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","MSTN; FGF5","Frontiers in genetics","Trio-Based Deep Sequencing Reveals a Low Incidence of Off-Target Mutations in the Offspring of Genetically Edited Goats.",2018,"9:449","[Li C et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China.",30356875,"10.3389/fgene.2018.00449 ","Unintended off-target mutations induced by CRISPR/Cas9 nucleases may result in unwanted consequences, which will impede the efficient applicability of this technology for genetic improvement. We have recently edited the goat genome through CRISPR/Cas9 by targeting MSTN and FGF5, which increased muscle fiber diameter and hair fiber length, respectively. Using family trio-based sequencing  that allow better discrimination of variant origins, we herein generated offspring from edited goats, and sequenced the members of four family trios (gene-edited goats and their offspring) to an average of approximately 36.8x coverage. This data was to systematically examined for mutation profiles using a  stringent pipeline that comprehensively analyzed the sequence data for de novo single nucleotide variants, indels, and structural variants from the genome. Our  results revealed that the incidence of de novo mutations in the offspring was equivalent to normal populations. We further conducted RNA sequencing using muscle and skin tissues from the offspring and control animals, the differentially expressed genes (DEGs) were related to muscle fiber development in muscles, skin development, and immune responses in skin tissues. Furthermore, in  contrast to recently reports of Cas9 triggered p53 expression alterations in cultured cells, we provide primary evidence to show that Cas9-mediated genetic modification does not induce apparent p53 expression changes in animal tissues. This work provides adequate molecular evidence to support the reliability of conducting Cas9-mediated genome editing in large animal models for biomedicine and agriculture.","goat","CRISPR / Cas9ヌクレアーゼによって誘発された意図しないオフターゲット変異は、望ましくない結果をもたらす可能性があり、遺伝的改善のためのこのテクノロジーの効率的な適用を妨げることになります。最近、MSTNとFGF5をターゲットにして、CRISPR / Cas9を介してヤギのゲノムを編集しました。これにより、それぞれ筋繊維の直径と毛髪の繊維の長さが増加しました。バリアントの起源のより良い識別を可能にするファミリートリオベースのシーケンスを使用して、ここでは編集されたヤギから子孫を生成し、4つのファミリートリオのメンバー（遺伝子編集されたヤギとその子孫）を平均約36.8倍のカバレッジにシーケンスしました。このデータは、ゲノムからのde novo一塩基多型、インデル、および構造変異体の配列データを包括的に分析する厳格なパイプラインを使用して、変異プロファイルについて体系的に調べられました。我々の結果は、子孫におけるdenovo突然変異の発生率が正常な集団と同等であることを明らかにした。さらに、子孫と対照動物の筋肉と皮膚組織を使用してRNAシーケンスを実施しました。発現差のある遺伝子（DEG）は、筋肉の筋線維の発達、皮膚の発達、皮膚組織の免疫反応に関連していました。さらに、Cas9が培養細胞でp53発現の変化を引き起こしたという最近の報告とは対照的に、Cas9を介した遺伝子改変が動物組織で明らかなp53発現の変化を誘発しないことを示す主要な証拠を提供します。この作業は、生物医学および農業用の大型動物モデルでCas9を介したゲノム編集を行うことの信頼性をサポートするための適切な分子的証拠を提供します。"]
[30,30180552,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","stearoyl-CoA desaturase 1","Journal of agricultural and food chemistry","CRISPR/Cas9-mediated Stearoyl-CoA Desaturase 1 (SCD1) Deficiency Affects Fatty Acid Metabolism in Goat Mammary Epithelial Cells.",2018,"66(38):10041-10052","[Tian H et al.]","Northwest A&F University , Yangling , China.",30180552,"10.1021/acs.jafc.8b03545 ","Stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) is a fatty acid desaturase catalyzing cis-double-bond formation in the Delta9 position to produce monounsaturated fatty acids essential for the synthesis of milk fat. Previous studies using RNAi methods have provided support for a role of SCD1 in goat mammary epithelial cells (GMEC); however, RNAi presents several limitations that might preclude a truthful understanding of the biological function of SCD1. To explore the function of SCD1 on fatty acid metabolism in GMEC, we used CRISPR-Cas9-mediated SCD1 knockout through non-homologous end-joining (NHEJ) and homology-directed repair (HDR) pathways in GMEC. We successfully introduced nucleotide deletions and mutations in the SCD1 gene locus through the NHEJ pathway and disrupted its second exon via insertion of an EGFP-PuroR segment using the HDR pathway. In clones derived from  the latter, gene- and protein-expression data indicated that we obtained a monoallelic SCD1 knockout. A T7EN1-mediated assay revealed no off-targets in the  surveyed sites. The contents of triacylglycerol and cholesterol and the desaturase index were significantly decreased as a consequence of SCD1 knockout.  The deletion of SCD1 decreased the expression of other genes involved in de novo  fatty acid synthesis, including SREBF1 and FASN, as well the fatty acid transporters FABP3 and FABP4. The downregulation of these genes partly explains the decrease of intracellular triacylglycerols. Our results indicate a successful SCD1 knockout in goat mammary cells using CRISPR-Cas9. The demonstration of the successful use of CRISPR-Cas9 in GMEC is an important step to producing transgenic goats to study mammary biology in vivo.","goat","ステアロイル-CoAデサチュラーゼ1（SCD1）は、Delta9位置でのシス二重結合形成を触媒する脂肪酸デサチュラーゼであり、乳脂肪の合成に不可欠な一価不飽和脂肪酸を生成します。RNAi法を使用した以前の研究では、ヤギ乳腺上皮細胞（GMEC）におけるSCD1の役割がサポートされています。ただし、RNAiには、SCD1の生物学的機能の真実の理解を妨げる可能性のあるいくつかの制限があります。GMECの脂肪酸代謝に対するSCD1の機能を調べるために、GMECの非相同末端結合（NHEJ）および相同性指向修復（HDR）経路を介したCRISPR-Cas9を介したSCD1ノックアウトを使用しました。NHEJ経路を介してSCD1遺伝子座にヌクレオチドの欠失と変異を導入し、HDR経路を使用してEGFP-PuroRセグメントを挿入することで2番目のエクソンを破壊しました。後者に由来するクローンでは、遺伝子およびタンパク質の発現データは、モノアレリックSCD1ノックアウトが得られたことを示しています。T7EN1を介したアッセイでは、調査したサイトにオフターゲットは見られませんでした。SCD1ノックアウトの結果として、トリアシルグリセロールとコレステロールの含有量およびデサチュラーゼ指数が大幅に減少しました。SCD1の削除は、SREBF1とFASN、および脂肪酸トランスポーターFABP3とFABP4を含む、denovo脂肪酸合成に関与する他の遺伝子の発現を減少させました。これらの遺伝子のダウンレギュレーションは、細胞内トリアシルグリセロールの減少を部分的に説明しています。私たちの結果は、CRISPR-Cas9を使用したヤギ乳腺細胞でのSCD1ノックアウトの成功を示しています。GMECでのCRISPR-Cas9の使用の成功の実証は、invivoで乳腺生物学を研究するためのトランスジェニックヤギを生産するための重要なステップです。"]
[31,28692815,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","growth differentiation factor 9 (GDF9)","Reproduction, fertility, and development","Efficient generation of goats with defined point mutation (I397V) in GDF9 through CRISPR/Cas9.",2018,"30(2):307-312","[Niu Y et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China.",28692815,"10.1071/RD17068 ","The recent emergence of the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system has attracted significant attention for its potential to improve traits of agricultural importance. However, most applications in livestock species to date have depended on aberrant DNA repair to generate frameshifting indels. Whether this genomic engineering technique involving homology-dependent repair (HDR) can be used to introduce defined point mutations has been less explored. Previously, we reported a G-->A point mutation (g.231A>G, p.Val397Ile) in the growth differentiation factor 9 (GDF9) gene that has a large effect on the litter size of cashmere goats. In the  present study we report that by co-injecting synthesised RNAs and single-stranded oligo deoxynucleotide (ssODN) donor sequences into goat zygotes, we successfully  introduced defined point mutations resulting in single amino acid substitutions in the proteins as expected. The efficiency of this precise single-nucleotide substitution in newborn kids was as high as 24% (4/17), indicating that ssODN-directed HDR via zygote injection is efficient at introducing point mutations in the goat genome. The findings of the present study further highlight the complex genome modifications facilitated by the CRISPR/Cas9 system, which is  able to introduce defined point mutations. This represents a significant development for the improvement of reproduction traits in goats, as well as for validating the roles of specific nucleotides in functional genetic elements in large animals.","goat","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連（Cas）9システムの最近の出現は、農業的に重要な特性を改善する可能性について大きな注目を集めています。ただし、これまでの家畜種のほとんどのアプリケーションは、フレームシフトインデルを生成するために異常なDNA修復に依存してきました。相同性依存修復（HDR）を含むこのゲノム工学技術を使用して、定義された点突然変異を導入できるかどうかについては、あまり検討されていません。以前、カシミヤヤギの同腹児数に大きな影響を与える成長分化因子9（GDF9）遺伝子のG-> A点突然変異（g.231A> G、p.Val397Ile）を報告しました。本研究では、合成RNAと一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）ドナー配列をヤギ接合子に同時注入することにより、予想通りタンパク質に単一アミノ酸置換をもたらす定義された点突然変異を導入することに成功したことを報告します。新生児におけるこの正確な一塩基置換の効率は24％（4/17）と高く、接合子注射によるssODN指向HDRがヤギゲノムに点突然変異を導入するのに効率的であることを示しています。本研究の結果は、定義された点突然変異を導入することができるCRISPR / Cas9システムによって促進される複雑なゲノム修飾をさらに強調しています。これは、ヤギの生殖特性の改善、および大型動物の機能的遺伝要素における特定のヌクレオチドの役割の検証のための重要な進展を表しています。"]
[32,30305304,"animal","Bama miniature pig","CRISPR;Cas9;","Apolipoprotein E (ApoE)","Disease models & mechanisms","Apolipoprotein E deficiency accelerates atherosclerosis development in miniature  pigs.",2018,"11(10)","[Fang B  et al.]","Nanjing Medical University, Nanjing, China.",30305304,"10.1242/dmm.036632 ","Miniature pigs have advantages over rodents in modeling atherosclerosis because their cardiovascular system and physiology are similar to that of humans. Apolipoprotein E (ApoE) deficiency has long been implicated in cardiovascular disease in humans. To establish an improved large animal model of familial hypercholesterolemia and atherosclerosis, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 system (CRISPR/Cas9) was  used to disrupt the ApoE gene in Bama miniature pigs. Biallelic-modified ApoE pigs with in-frame mutations (ApoE(m/m) ) and frameshift mutations (ApoE(-/-) ) were simultaneously produced. ApoE(-/-) pigs exhibited moderately increased plasma cholesterol levels when fed with a regular chow diet, but displayed severe hypercholesterolemia and spontaneously developed human-like atherosclerotic lesions in the aorta and coronary arteries after feeding on a high-fat and high-cholesterol (HFHC) diet for 6 months. Thus, these ApoE(-/-) pigs could be valuable large animal models for providing further insight into translational studies of atherosclerosis.","pig","ミニブタは、心臓血管系と生理機能が人間と似ているため、アテローム性動脈硬化症のモデリングにおいてげっ歯類よりも優れています。アポリポタンパク質E（ApoE）の欠乏は、長い間、人間の心血管疾患に関係しています。家族性高コレステロール血症とアテローム性動脈硬化症の改善された大型動物モデルを確立するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）関連タンパク質9システム（CRISPR / Cas9）を使用して、バマミニチュアブタのApoE遺伝子を破壊しました。フレーム内変異（ApoE（m / m））とフレームシフト変異（ApoE（-/-））を持つバイアレリック修飾ApoEブタが同時に生産されました。ApoE（-/-）豚は、通常の固形飼料を与えた場合、血漿コレステロール値が中程度に上昇しましたが、高脂肪および高コレステロールを与えた後、重度の高コレステロール血症を示し、大動脈および冠状動脈にヒトのようなアテローム性動脈硬化症を自然に発症しました。 （HFHC）6ヶ月間の食事。したがって、これらのApoE（-/-）豚は、アテローム性動脈硬化症の翻訳研究へのさらなる洞察を提供するための貴重な大型動物モデルである可能性があります。"]
[33,30127453,"animal","Guangxi Bama minipig","CRISPR;Cas9;","SCNA","Scientific reports","CRISPR/Cas9-Mediated Generation of Guangxi Bama Minipigs Harboring Three Mutations in alpha-Synuclein Causing Parkinson's Disease.",2018,"8(1):12420","[Zhu XX  et al.]","Guangxi University,  Nanning, China.",30127453,"10.1038/s41598-018-30436-3 ","Parkinson's disease (PD) is a common, progressive neurodegenerative disorder characterized by classical motor dysfunction and is associated with alpha-synuclein-immunopositive pathology and the loss of dopaminergic neurons in  the substantia nigra (SN). Several missense mutations in the alpha-synuclein gene SCNA have been identified as cause of inherited PD, providing a practical strategy to generate genetically modified animal models for PD research. Since minipigs share many physiological and anatomical similarities to humans, we proposed that genetically modified minipigs carrying PD-causing mutations can serve as an ideal model for PD research. In the present study, we attempted to model PD by generating Guangxi Bama minipigs with three PD-causing missense mutations (E46K, H50Q and G51D) in SCNA using CRISPR/Cas9-mediated gene editing combining with somatic cell nuclear transfer (SCNT) technique. We successfully generated a total of eight SCNT-derived Guangxi Bama minipigs with the desired heterozygous SCNA mutations integrated into genome, and we also confirmed by DNA  sequencing that these minipigs expressed mutant alpha-synuclein at the transcription level. However, immunohistochemical analysis was not able to detect PD-specific pathological changes such as alpha-synuclein-immunopositive pathology and loss of SN dopaminergic neurons in the gene-edited minipigs at 3 months of age. In summary, we successfully generated Guangxi Bama minipigs harboring three  PD-casusing mutations (E46K, H50Q and G51D) in SCNA. As they continue to develop, these gene editing minipigs need to be regularly teseted for the presence of PD-like pathological features in order to validate the use of this large-animal model in PD research.","pig","パーキンソン病（PD）は、古典的な運動機能障害を特徴とする一般的な進行性神経変性疾患であり、α-シヌクレイン免疫陽性の病状と黒質（SN）のドーパミン作動性ニューロンの喪失に関連しています。α-シヌクレイン遺伝子SCNAのいくつかのミスセンス変異は、遺伝性PDの原因として特定されており、PD研究用の遺伝子改変動物モデルを生成するための実用的な戦略を提供します。ミニブタは人間と多くの生理学的および解剖学的類似点を共有しているため、PDを引き起こす変異を持つ遺伝子組み換えミニブタがPD研究の理想的なモデルとして役立つ可能性があることを提案しました。本研究では、体細胞核移植（SCNT）技術と組み合わせたCRISPR / Cas9を介した遺伝子編集を使用して、SCNAで3つのPDを引き起こすミスセンス変異（E46K、H50Q、G51D）を持つGuangxiBamaミニブタを生成することによってPDのモデル化を試みました。ゲノムに組み込まれた目的のヘテロ接合SCNA変異を持つ合計8つのSCNT由来のGuangxiBamaミニブタの生成に成功し、これらのミニブタが転写レベルで変異α-シヌクレインを発現していることもDNAシーケンシングによって確認しました。ただし、免疫組織化学的分析では、α-シヌクレイン免疫陽性の病理や、3か月齢の遺伝子編集ミニブタにおけるSNドーパミン作動性ニューロンの喪失などのPD固有の病理学的変化を検出できませんでした。要約すると、SCNAで3つのPDを引き起こす変異（E46K、H50Q、G51D）を含む広西チワン族自治区のミニブタの生成に成功しました。それらが開発を続けるにつれて、これらの遺伝子編集ミニブタは、PD研究におけるこの大型動物モデルの使用を検証するために、PDのような病理学的特徴の存在について定期的にテセットされる必要があります。"]
[34,29354381,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","UL16-binding protein 1","3 Biotech","The production of UL16-binding protein 1 targeted pigs using CRISPR technology.",2018,"8(1):70","[Joanna Z et al.]","Poznan University of Life Sciences, Poznan, Poland.",29354381,"10.1007/s13205-018-1107-4 ","Two sgRNAs were designed to target the region of exon 2 of the pULBP1 gene by microinjection. The co-injection of modified Cas9-D10A nickase with a pair of sgRNAs into the zygote's cytoplasm easily and efficiently generated biallelic modification of the pULBP1 gene in one step. Five out of nine F0 generation piglets showed insertions or deletions in the targeting site of the pULBP1 gene,  indicating that pULBP1 mutation efficiency reached about 56% (5/9). Quantitative  determination of pULBP1 showed approximately a 1.53-fold reduction in the amount  of protein ULBP1 on the cell surface (ELISA). A human NK-cell cytotoxicity test leads to the conclusion that higher cell viability is observed for -/- ULBP1 (survival rate 85.36%) compared to +/+ ULBP1 (69.58%). ULBP1-KO pigs will provide a more progressive xenograft source for further research studies, especially those measuring the effects of abolishing the gene function in terms of the complexity of the immunological interactions.","pig","2つのsgRNAは、マイクロインジェクションによってpULBP1遺伝子のエクソン2の領域をターゲットにするように設計されました。修飾されたCas9-D10AニッカーゼとsgRNAのペアを接合子の細胞質に同時注入すると、pULBP1遺伝子の2対立遺伝子修飾が1つのステップで簡単かつ効率的に生成されました。9つのF0世代の子豚のうち5つは、pULBP1遺伝子の標的部位に挿入または欠失を示し、pULBP1の突然変異効率が約56％（5/9）に達したことを示しています。pULBP1の定量分析では、細胞表面（ELISA）上のタンパク質ULBP1の量が約1.53分の1に減少したことが示されました。ヒトNK細胞細胞毒性試験は、+ / + ULBP1（69.58％）と比較して-/-ULBP1（生存率85.36％）でより高い細胞生存率が観察されるという結論につながります。ULBP1-KOブタは、さらなる研究研究、特に免疫学的相互作用の複雑さの観点から遺伝子機能を廃止する効果を測定する研究のために、より進歩的な異種移植片源を提供します。"]
[35,29631050,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","alpha(1,3) galactosyltransferase (GGTA1 gene); CMP-Neu5Ac hydroxylase (CMAH gene); beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2 (beta4GalNT2)","Acta biomaterialia","Reducing immunoreactivity of porcine bioprosthetic heart valves by genetically-deleting three major glycan antigens, GGTA1/beta4GalNT2/CMAH.",2018,"72:196-205","[Zhang R et al.]","Nanjing Medical University, Nanjing, China.",29631050,"10.1016/j.actbio.2018.03.055 ","Bioprosthetic heart valves (BHVs) originating from pigs are extensively used for  heart valve replacement in clinics. However, recipient immune responses associated with chronic calcification lead to structural valve deterioration (SVD) of BHVs. Two well-characterized epitopes on porcine BHVs have been implicated in SVD, including galactose-alpha1,3-galactose (alphaGal) and N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) whose synthesis are catalyzed by alpha(1,3) galactosyltransferase (encoded by the GGTA1 gene) and CMP-Neu5Ac hydroxylase (encoded by the CMAH gene), respectively. It has been reported that BHV from alphaGal-knockout pigs are associated with a significantly reduced immune response by human serum. Moreover, valves from alphaGal/Neu5Gc-deficient pigs could further reduce human IgM/IgG binding when compared to BHV from alphaGal-knockout pigs. Recently, another swine xenoantigen, Sd(a), produced by beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2 (beta4GalNT2), has been identified. To explore whether tissue from GGTA1, CMAH, and beta4GalNT2 triple gene-knockout (TKO) pigs would further minimize human antibody binding to porcine pericardium, TKO pigs were successfully produced by CRISPR/Cas9 mediated gene targeting. Our results showed that the expression of alphaGal, Neu5G and Sd(a) on TKO pigs was negative, and that human IgG/IgM binding to pericardium was minimal. Moreover, the analysis of collagen composition and physical characteristics of porcine pericardium from the TKO pigs indicated that elimination of the three xenoantigens had no significant impact on the physical proprieties of porcine pericardium. Our results demonstrated that TKO pigs would be an ideal source of BHVs. STATEMENT OF SIGNIFICANCE: Surgical heart valve replacement is an established lifesaving treatment for diseased heart valve. Bioprosthetic heart valves (BHVs) made from glutaraldehyde-fixed porcine or bovine tissues are widely used in clinics but exhibit age-dependent structural valve degeneration (SVD) which is associated with the immune response against BHVs. Three major xenoantigens present on commercial BHVs, Galactosea alpha1,3 galactose (alphaGal), N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) and glycan products of beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2 (beta4GalNT2) are eliminated through CRISPR/Cas9 mediated gene targeting in the present study. The genetically modified porcine pericardium showed reduced immunogenicity but comparable collagen composition and physical characteristics of the pericardium from wild-type pigs. Our data suggested that BHVs from TKO pigs is a promising alternative for currently available BHVs from wild-type pigs.","pig","ブタに由来する生体人工心臓弁（BHV）は、診療所での心臓弁置換術に広く使用されています。ただし、慢性石灰化に関連するレシピエントの免疫反応は、BHVの構造的弁劣化（SVD）につながります。ガラクトース-α1,3-ガラクトース（alphaGal）とN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）を含む、ブタBHVの2つのよく特徴付けられたエピトープは、SVDに関与しており、その合成はα（1,3）ガラクトシルトランスフェラーゼ（GGTA1によってコードされる）によって触媒されます。遺伝子）およびCMP-Neu5Acヒドロキシラーゼ（CMAH遺伝子によってコードされる）、それぞれ。alphaGalノックアウトブタのBHVは、ヒト血清による免疫反応の大幅な低下に関連していることが報告されています。さらに、alphaGal / Neu5Gc欠損ブタの弁は、alphaGalノックアウトブタのBHVと比較した場合、ヒトIgM / IgG結合をさらに低下させる可能性があります。最近、ベータ-1,4-N-アセチル-ガラクトサミニルトランスフェラーゼ2（beta4GalNT2）によって産生される別のブタ異種抗原Sd（a）が同定されました。GGTA1、CMAH、およびbeta4GalNT2トリプル遺伝子ノックアウト（TKO）ブタの組織が、ブタの心膜へのヒト抗体の結合をさらに最小限に抑えるかどうかを調べるために、CRISPR / Cas9を介した遺伝子ターゲティングによってTKOブタの作製に成功しました。我々の結果は、TKOブタにおけるalphaGal、Neu5G、およびSd（a）の発現が陰性であり、心膜へのヒトIgG / IgMの結合が最小限であることを示しました。さらに、TKOブタからのブタ心膜のコラーゲン組成および物理的特性の分析は、3つの異種抗原の除去がブタ心膜の物理的特性に有意な影響を及ぼさなかったことを示した。私たちの結果は、TKO豚がBHVの理想的な供給源になることを示しました。重要性の声明：外科的心臓弁置換術は、病気の心臓弁の確立された救命治療です。グルタルアルデヒドで固定されたブタまたはウシの組織から作られた生体人工心臓弁（BHV）は診療所で広く使用されていますが、BHVに対する免疫応答に関連する年齢依存性の構造的弁変性（SVD）を示します。市販のBHVに存在する3つの主要な異種抗原、ガラクトシーalpha1,3ガラクトース（alphaGal）、N-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）、およびベータ-1,4-N-アセチル-ガラクトサミニルトランスフェラーゼ2（beta4GalNT2）のグリカン生成物はCRISPR / Cas9によって排除されます本研究における媒介遺伝子ターゲティング。遺伝子組み換えブタの心膜は免疫原性の低下を示しましたが、野生型ブタの心膜のコラーゲン組成と物理的特性は同等でした。私たちのデータは、TKO豚からのBHVが、野生型豚から現在入手可能なBHVの有望な代替手段であることを示唆しています。"]
[36,30048323,"animal","pig","CRISPR;Cas","Gal; Sda","Annals of surgery","Xenoantigen Deletion and Chemical Immunosuppression Can Prolong Renal Xenograft Survival.",2018,"268(4):564-573","[Adams AB et al.]","Emory School of Medicine, Atlanta, GA, USA.",30048323,"10.1097/SLA.0000000000002977 ","OBJECTIVE: Xenotransplantation using pig organs could end the donor organ shortage for transplantation, but humans have xenoreactive antibodies that cause  early graft rejection. Genome editing can eliminate xenoantigens in donor pigs to minimize the impact of these xenoantibodies. Here we determine whether an improved cross-match and chemical immunosuppression could result in prolonged kidney xenograft survival in a pig-to-rhesus preclinical model. METHODS: Double xenoantigen (Gal and Sda) knockout (DKO) pigs were created using CRISPR/Cas. Serum from rhesus monkeys (n = 43) was cross-matched with cells from the DKO pigs. Kidneys from the DKO pigs were transplanted into rhesus monkeys (n = 6) that had the least reactive cross-matches. The rhesus recipients were immunosuppressed with anti-CD4 and anti-CD8 T-cell depletion, anti-CD154, mycophenolic acid, and steroids. RESULTS: Rhesus antibody binding to DKO cells is reduced, but all still have positive CDC and flow cross-match. Three grafts were  rejected early at 5, 6, and 6 days. Longer survival was achieved in recipients with survival to 35, 100, and 435 days. Each of the 3 early graft losses was secondary to IgM antibody-mediated rejection. The 435-day graft loss occurred secondary to IgG antibody-mediated rejection. CONCLUSIONS: Reducing xenoantigens  in donor pigs and chemical immunosuppression can be used to achieve prolonged renal xenograft survival in a preclinical model, suggesting that if a negative cross-match can be obtained for humans then prolonged survival could be achieved.","pig","目的：ブタの臓器を使用した異種移植は、移植のためのドナー臓器の不足を終わらせることができますが、ヒトは早期の移植片拒絶を引き起こす異種反応性抗体を持っています。ゲノム編集により、ドナーブタの異種抗原を排除して、これらの異種抗体の影響を最小限に抑えることができます。ここでは、交差適合試験と化学的免疫抑制の改善により、ブタからアカゲザルへの前臨床モデルで腎臓異種移植片の生存期間が延長されるかどうかを判断します。方法：ダブル異種抗原（GalおよびSda）ノックアウト（DKO）ブタは、CRISPR / Casを使用して作成されました。アカゲザル（n = 43）の血清は、DKOブタの細胞と交差適合試験されました。DKO豚の腎臓は、交差適合試験の反応性が最も低いアカゲザル（n = 6）に移植されました。アカゲザルのレシピエントは、抗CD4および抗CD8 T細胞枯渇、抗CD154、ミコフェノール酸、およびステロイドで免疫抑制されました。結果：DKO細胞へのアカゲザル抗体の結合は減少しますが、すべてが陽性のCDCとフロークロスマッチを持っています。3つの移植片は、5、6、および6日の早い段階で拒否されました。35日、100日、および435日までの生存期間を持つレシピエントでより長い生存期間が達成されました。3つの初期移植片喪失のそれぞれは、IgM抗体を介した拒絶反応に続発したものでした。435日間の移植片喪失は、IgG抗体を介した拒絶反応に続発して発生しました。結論：ドナーブタの異種抗原の減少と化学的免疫抑制を使用して、前臨床モデルで腎異種移植片の生存期間を延長することができます。これは、ヒトで負の交差適合試験が得られれば、生存期間の延長を達成できることを示唆しています。"]
[37,29337166,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","CD163","Antiviral research","CD163 knockout pigs are fully resistant to highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus.",2018,"151:63-70","[Yang H et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, China.",29337166,"10.1016/j.antiviral.2018.01.004 ","Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) causes severe economic losses to current swine production worldwide. Highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV), originated from a genotype 2 PRRSV, is more virulent than classical PRRSV and further exacerbates the economic impact. HP-PRRSV has become the predominant circulating field strain in China since 2006. CD163 is a cellular receptor for PRRSV. The depletion of CD163 whole protein or SRCR5 region (interaction site for the virus) confers resistance to infection of several PRRSV isolates in pigs or cultured host cells. In this study, we described the generation of a CD163 knockout (KO) pig in which the CD163 protein was ablated by using CRISPR/Cas9 gene targeting and somatic cell nuclear transfer (SCNT) technologies. Challenge with HP-PRRSV TP strain showed that CD163 KO pigs are completely resistant to viral infection manifested by the absence of viremia, antibody response, high fever or any other PRRS-associated clinical signs. By comparison, wild-type (WT) controls displayed typical signs of PRRSV infection and died within 2 weeks after infection. Deletion of CD163 showed no adverse effects to the macrophages on immunophenotyping and biological activity as hemoglobin-haptoglobin scavenger. The results demonstrated that CD163 knockout confers full resistance to HP-PRRSV infection to pigs without impairing the biological function associated with the gene.","pig","豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）は、世界中の現在の豚生産に深刻な経済的損失をもたらします。遺伝子型2PRRSVに由来する高病原性PRRSV（HP-PRRSV）は、古典的なPRRSVよりも毒性が高く、経済的影響をさらに悪化させます。HP-PRRSVは、2006年以降、中国で優勢な循環野外株になりました。CD163はPRRSVの細胞受容体です。CD163全タンパク質またはSRCR5領域（ウイルスの相互作用部位）の枯渇は、ブタまたは培養宿主細胞におけるいくつかのPRRSV分離株の感染に対する耐性を付与します。この研究では、CRISPR / Cas9遺伝子ターゲティングと体細胞核移植（SCNT）技術を使用してCD163タンパク質を除去したCD163ノックアウト（KO）ブタの生成について説明しました。HP-PRRSV TP株によるチャレンジでは、CD163 KOブタは、ウイルス血症、抗体反応、高熱、またはその他のPRRS関連の臨床症状がないことから明らかなウイルス感染に対して完全に耐性があることが示されました。比較すると、野生型（WT）コントロールは、PRRSV感染の典型的な兆候を示し、感染後2週間以内に死亡しました。CD163の削除は、ヘモグロビン-ハプトグロビンスカベンジャーとしての免疫表現型および生物活性に対するマクロファージへの悪影響を示さなかった。結果は、CD163ノックアウトが遺伝子に関連する生物学的機能を損なうことなくブタにHP-PRRSV感染に対する完全な耐性を与えることを示しました。"]
[38,29268580,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","cluster of differentiation 163 (CD163)","Asian-Australasian journal of animal sciences","Multi-resistance strategy for viral diseases and in vitro short hairpin RNA verification method in pigs.",2018,"31(4):489-498","[Oh JN et al.]","Seoul National University,  Seoul, Korea.",29268580,"10.5713/ajas.17.0749 ","OBJECTIVE: Foot and mouth disease (FMD) and porcine reproductive and respiratory  syndrome (PRRS) are major diseases that interrupt porcine production. Because they are viral diseases, vaccinations are of only limited effectiveness in preventing outbreaks. To establish an alternative multi-resistant strategy against FMD virus (FMDV) and PRRS virus (PRRSV), the present study introduced two genetic modification techniques to porcine cells. METHODS: First, cluster of differentiation 163 (CD163), the PRRSV viral receptor, was edited with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated protein 9 technique. The CD163 gene sequences of edited cells and control cells differed. Second, short hairpin RNA (shRNAs) were integrated into the cells. The  shRNAs, targeting the 3D gene of FMDV and the open reading frame 7 (ORF7) gene of PRRSV, were transferred into fibroblasts. We also developed an in vitro shRNA verification method with a target gene expression vector. RESULTS: shRNA activity was confirmed in vitro with vectors that expressed the 3D and ORF7 genes in the cells. Cells containing shRNAs showed lower transcript levels than cells with only the expression vectors. The shRNAs were integrated into CD163-edited cells to combine the two techniques, and the viral genes were suppressed in these cells. CONCLUSION: We established a multi-resistant strategy against viral diseases and an in vitro shRNA verification method.","pig","目的：口蹄疫（FMD）および豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は、豚の生産を妨げる主要な病気です。それらはウイルス性疾患であるため、ワクチン接種は発生を防ぐのに限られた効果しかありません。FMDウイルス（FMDV）およびPRRSウイルス（PRRSV）に対する代替のマルチ耐性戦略を確立するために、本研究では、ブタ細胞に2つの遺伝子改変技術を導入しました。方法：最初に、PRRSVウイルス受容体である分化クラスター163（CD163）を、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート-CRISPR関連タンパク質9技術で編集しました。編集された細胞と対照細胞のCD163遺伝子配列は異なっていた。次に、ショートヘアピンRNA（shRNA）が細胞に組み込まれました。FMDVの3D遺伝子とPRRSVのオープンリーディングフレーム7（ORF7）遺伝子を標的とするshRNAは、線維芽細胞に移されました。また、標的遺伝子発現ベクターを用いたin vitroshRNA検証法を開発しました。結果：shRNA活性は、細胞内で3DおよびORF7遺伝子を発現するベクターを用いてinvitroで確認されました。shRNAを含む細胞は、発現ベクターのみを含む細胞よりも低い転写レベルを示しました。shRNAはCD163で編集された細胞に組み込まれ、2つの技術を組み合わせ、ウイルス遺伝子はこれらの細胞で抑制されました。結論：ウイルス性疾患に対するマルチ耐性戦略とinvitroshRNA検証法を確立しました。"]
[39,29545179,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","FBXO40","Biochemical and biophysical research communications","An FBXO40 knockout generated by CRISPR/Cas9 causes muscle hypertrophy in pigs without detectable pathological effects.",2018,"498(4):940-945","[Zou Y et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29545179,"10.1016/j.bbrc.2018.03.085 ","The regulatory function of Fbxo40 has been well characterized in mice. As a key component of the SCF-E3 ubiquitin ligase complex, Fbxo40 induces IRS1 ubiquitination, thus inactivating the IGF1/Akt pathway. The expression of Fbxo40  is restricted to muscle, and mice with an Fbxo40 null mutation exhibit muscle hypertrophy. However, the function of FBXO40 has not been elucidated in pigs, and it is not known whether FBXO40 mutations affect their health. We therefore generated FBXO40 knockout pigs using somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology. CRISPR/Cas9 technology was combined with G418 selection, making it possible to generate donor cells at an efficiency of 75.86%. In muscle from FBXO40 knockout pigs, IRS1 levels were higher, and the IGF1/Akt pathway was stimulated. Mutant animals also had approximately 4% more muscle mass compared to WT controls. The knockout pigs developed normally and no pathological changes were found in major organs. These results demonstrate that FBXO40 is a promising  candidate gene for improving production traits in agricultural livestock and for  developing therapeutic interventions for muscle diseases.","pig","Fbxo40の調節機能は、マウスで十分に特徴付けられています。SCF-E3ユビキチンリガーゼ複合体の重要な構成要素として、Fbxo40はIRS1ユビキチン化を誘導し、IGF1 / Akt経路を不活性化します。Fbxo40の発現は筋肉に限定されており、Fbxo40null変異を持つマウスは筋肉肥大を示します。しかし、FBXO40の機能は豚では解明されておらず、FBXO40の変異が豚の健康に影響を与えるかどうかは不明です。したがって、体細胞核移植（SCNT）技術を使用してFBXO40ノックアウトブタを生成しました。CRISPR / Cas9テクノロジーをG418選択と組み合わせることで、75.86％の効率でドナー細胞を生成することが可能になりました。FBXO40ノックアウトブタの筋肉では、IRS1レベルが高く、IGF1 / Akt経路が刺激されました。突然変異動物はまた、WT対照と比較して約4％多い筋肉量を持っていた。ノックアウトブタは正常に発育し、主要な臓器に病理学的変化は見られませんでした。これらの結果は、FBXO40が農業家畜の生産特性を改善し、筋肉疾患の治療的介入を開発するための有望な候補遺伝子であることを示しています。"]
[40,29601977,"animal","pig","CRISPR;Cas9;TALENs;","SURF1","Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease","SURF1 knockout cloned pigs: Early onset of a severe lethal phenotype.",2018,"1864(6 Pt A):2131-2142","[Quadalti C et al.]","Avantea, Cremona, Italy.",29601977,"10.1016/j.bbadis.2018.03.021 ","Leigh syndrome (LS) associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency is an early onset, fatal mitochondrial encephalopathy, leading to multiple neurological failure and eventually death, usually in the first decade of life. Mutations in SURF1, a nuclear gene encoding a mitochondrial protein involved in COX assembly,  are among the most common causes of LS. LS(SURF1) patients display severe, isolated COX deficiency in all tissues, including cultured fibroblasts and skeletal muscle. Recombinant, constitutive SURF1(-/-) mice show diffuse COX deficiency, but fail to recapitulate the severity of the human clinical phenotype. Pigs are an attractive alternative model for human diseases, because of their size, as well as metabolic, physiological and genetic similarity to humans. Here, we determined the complete sequence of the swine SURF1 gene, disrupted it in pig primary fibroblast cell lines using both TALENs and CRISPR/Cas9 genome editing systems, before finally generating SURF1(-/-) and SURF1(-/+) pigs by Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT). SURF1(-/-) pigs were characterized by failure to thrive, muscle weakness and highly reduced life span  with elevated perinatal mortality, compared to heterozygous SURF1(-/+) and wild type littermates. Surprisingly, no obvious COX deficiency was detected in SURF1(-/-) tissues, although histochemical analysis revealed the presence of COX  deficiency in jejunum villi and total mRNA sequencing (RNAseq) showed that several COX subunit-encoding genes were significantly down-regulated in SURF1(-/-) skeletal muscles. In addition, neuropathological findings, indicated a delay in central nervous system development of newborn SURF1(-/-) piglets. Our results suggest a broader role of sSURF1 in mitochondrial bioenergetics.","pig","シトクロムcオキシダーゼ（COX）欠損症に関連するリー脳症（LS）は、早期発症の致命的なミトコンドリア脳症であり、通常は生後10年間で、複数の神経学的障害を引き起こし、最終的には死に至ります。COXアセンブリに関与するミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子であるSURF1の変異は、LSの最も一般的な原因の1つです。LS（SURF1）患者は、培養線維芽細胞や骨格筋を含むすべての組織で重度の孤立したCOX欠損症を示します。組換え、構成的SURF1（-/-）マウスは、びまん性COX欠損症を示しますが、ヒトの臨床表現型の重症度を再現することはできません。ブタは、そのサイズ、ならびにヒトとの代謝的、生理学的および遺伝的類似性のために、ヒトの疾患の魅力的な代替モデルです。ここでは、ブタのSURF1遺伝子の完全な配列を決定し、TALENとCRISPR / Cas9ゲノム編集システムの両方を使用してブタの初代線維芽細胞株で破壊した後、最終的にSURF1（-/-）およびSURF1（-/ +）ブタを生成しました。体細胞核移植（SCNT）。SURF1（-/-）豚は、ヘテロ接合のSURF1（-/ +）および野生型同腹仔と比較して、成長障害、筋力低下、および周産期死亡率の上昇を伴う寿命の大幅な短縮を特徴としていました。驚くべきことに、SURF1（-/-）組織では明らかなCOX欠損は検出されませんでしたが、組織化学的分析により空腸絨毛にCOX欠損が存在することが明らかになり、トータルmRNAシーケンシング（RNAseq）により、いくつかのCOXサブユニットをコードする遺伝子が有意にダウンレギュレートされたことが示されました。 SURF1（-/-）骨格筋。さらに、神経病理学的所見は、新生児SURF1（-/-）子豚の中枢神経系の発達の遅れを示した。私たちの結果は、ミトコンドリアの生体エネルギー学におけるsSURF1のより広い役割を示唆しています。"]
[41,29363554,"animal","pig","TALENs;","miR-192","Bioscience reports","Insight into the molecular mechanism of miR-192 regulating Escherichia coli resistance in piglets.",2018,"38(1)","[Sun L et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, China.",29363554,"10.1042/BSR20171160 ","MicroRNAs (miRNAs) have important roles in many cellular processes, including cell proliferation, growth and development, and disease control. Previous study demonstrated that the expression of two highly homologous miRNAs (miR-192 and miR-215) was up-regulated in weaned piglets with Escherichia coli F18 infection.  However, the potential molecular mechanism of miR-192 in regulating E. coli infection remains unclear in pigs. In the present study, we analyzed the relationship between level of miR-192 and degree of E. coli resistance using transcription activator-like effector nuclease (TALEN), in vitro bacterial adhesion assays, and target genes research. A TALEN expression vector that specifically recognizes the pig miR-192 was constructed and then monoclonal epithelial cells defective in miR-192 were established. We found that miR-192 knockout led to enhance the adhesion ability of the E. coli strains F18ab, F18ac  and K88ac, meanwhile increase the expression of target genes (DLG5 and ALCAM) by  qPCR and Western blotting analysis. The results suggested that miR-192 and its key target genes (DLG5 and ALCAM) could have a key role in E. coli infection. Based on our findings, we propose that further investigation of miR-192 function  is likely to lead to insights into the molecular mechanisms of E. coli infection.","pig","マイクロRNA（miRNA）は、細胞の増殖、成長と発達、病気の制御など、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。以前の研究では、2つの高度に相同なmiRNA（miR-192およびmiR-215）の発現が、大腸菌F18感染の離乳した子豚でアップレギュレートされたことが示されました。ただし、大腸菌感染の調節におけるmiR-192の潜在的な分子メカニズムはブタでは不明なままです。本研究では、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、in vitro細菌接着アッセイ、および標的遺伝子研究を使用して、miR-192のレベルと大腸菌耐性の程度との関係を分析しました。ブタmiR-192を特異的に認識するTALEN発現ベクターを構築し、miR-192に欠陥のあるモノクローナル上皮細胞を樹立しました。miR-192ノックアウトにより、大腸菌株F18ab、F18ac、K88acの接着能力が向上し、qPCRとウエスタンブロッティング分析により標的遺伝子（DLG5とALCAM）の発現が増加することがわかりました。結果は、miR-192とその主要な標的遺伝子（DLG5とALCAM）が大腸菌感染において重要な役割を果たす可能性があることを示唆しました。我々の発見に基づいて、miR-192機能のさらなる調査が大腸菌感染の分子メカニズムへの洞察につながる可能性が高いことを提案します。"]
[42,29570443,"animal","pig","Cas9;","A sequence from the mMalat1 gene","BioTechniques","Single step production of Cas9 mRNA for zygote injection.",2018,"64(3):118-124","[Redel BK et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",29570443,"10.2144/btn-2017-0116 ","Production of Cas9 mRNA in vitro typically requires the addition of a 5 cap and 3 polyadenylation. A plasmid was constructed that harbored the T7 promoter followed by the EMCV IRES and a Cas9 coding region. We hypothesized that the use of the metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (Malat1) triplex structure downstream of an IRES/Cas9 expression cassette would make polyadenylation of in vitro produced mRNA unnecessary. A sequence from the mMalat1 gene was cloned downstream of the IRES/Cas9 cassette described above. An mRNA concentration curve was constructed with either commercially available Cas9 mRNA or the IRES/ Cas9/triplex, by injection into porcine zygotes. Blastocysts were genotyped to determine if differences existed in the percent of embryos modified. The concentration curve identified differences due to concentration and RNA type injected. Single step production of Cas9 mRNA provides an alternative source of Cas9 for use in zygote injections.","pig","invitroでのCas9mRNAの生成には、通常、5キャップと3ポリアデニル化の追加が必要です。T7プロモーターとそれに続くEMCVIRESおよびCas9コード領域を含むプラスミドを構築しました。IRES / Cas9発現カセットの下流にある転移関連肺腺癌転写物1（Malat1）トリプレックス構造を使用すると、invitroで生成されたmRNAのポリアデニル化が不要になると仮定しました。mMalat1遺伝子の配列は、上記のIRES / Cas9カセットの下流にクローニングされました。ブタの接合子に注入することにより、市販のCas9mRNAまたはIRES / Cas9 / triplexのいずれかを使用してmRNA濃度曲線を作成しました。胚盤胞の遺伝子型を決定して、改変された胚の割合に違いが存在するかどうかを判断しました。濃度曲線は、注入された濃度とRNAタイプによる違いを特定しました。Cas9 mRNAのシングルステップ生成は、接合子注射で使用するためのCas9の代替ソースを提供します。"]
[43,29606351,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","huntingtin","Cell","A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington's Disease.",2018,"173(4):989-1002.e13","[Yan S et al.]","Jinan University, Guangzhou, China.",29606351,"10.1016/j.cell.2018.03.005 ","Huntington's disease (HD) is characterized by preferential loss of the medium spiny neurons in the striatum. Using CRISPR/Cas9 and somatic nuclear transfer technology, we established a knockin (KI) pig model of HD that endogenously expresses full-length mutant huntingtin (HTT). By breeding this HD pig model, we  have successfully obtained F1 and F2 generation KI pigs. Characterization of founder and F1 KI pigs shows consistent movement, behavioral abnormalities, and early death, which are germline transmittable. More importantly, brains of HD KI  pig display striking and selective degeneration of striatal medium spiny neurons. Thus, using a large animal model of HD, we demonstrate for the first time that overt and selective neurodegeneration seen in HD patients can be recapitulated by endogenously expressed mutant proteins in large mammals, a finding that also underscores the importance of using large mammals to investigate the pathogenesis of neurodegenerative diseases and their therapeutics.","pig","ハンチントン病（HD）は、線条体の中型有棘ニューロンの優先的な喪失を特徴としています。CRISPR / Cas9と体細胞核移植技術を使用して、完全長変異ハンチンチン（HTT）を内因的に発現するHDのノックイン（KI）ブタモデルを確立しました。このHD豚モデルを繁殖させることにより、F1およびF2世代のKI豚の取得に成功しました。創始者とF1KI豚の特徴は、生殖細胞系列に伝達可能な一貫した動き、行動異常、早期死亡を示しています。さらに重要なことに、HD KIブタの脳は、線条体の中型有棘ニューロンの顕著な選択的変性を示します。したがって、HDの大型動物モデルを使用して、HD患者に見られる明白で選択的な神経変性が、大型哺乳類で内因的に発現する変異タンパク質によって再現できることを初めて実証します。これは、大型哺乳類を使用して調査することの重要性も強調しています。神経変性疾患の病因とその治療法。"]
[44,30259067,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","insulin-like growth factor 2","Cellular and molecular life sciences","Editing porcine IGF2 regulatory element improved meat production in Chinese Bama  pigs.",2018,"75(24):4619-4628","[Xiang G  et al.]","Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30259067,"10.1007/s00018-018-2917-6 ","Insulin-like growth factor 2 (IGF2) is an important growth factor, which promotes growth and development in mammals during fetal and postnatal stages. Using CRISPR-Cas9 system, we generated multiple founder pigs containing 12 different mutant alleles around a regulatory element within the intron 3 of IGF2 gene. Crossing two male founders passed four mutant alleles onto F1 generation, and these mutations abolished repressor ZBED6 binding and rendered this regulatory element nonfunctional. Both founders and F1 animals showed significantly faster growth, without affecting meat quality. These results indicated that editing IGF2 intron 3-3072 site using CRISPR-Cas9 technology improved meat production in Bama  pigs. This is the first demonstration that editing non-coding region can improve  economic traits in livestock.","pig","インスリン様成長因子2（IGF2）は重要な成長因子であり、胎児および出生後の段階で哺乳類の成長と発達を促進します。CRISPR-Cas9システムを使用して、IGF2遺伝子のイントロン3内の調節エレメントの周りに12の異なる変異対立遺伝子を含む複数の創始者ブタを生成しました。2人の男性の創始者を交配すると、4つの変異対立遺伝子がF1世代に渡され、これらの変異によりリプレッサーZBED6の結合が失われ、この調節エレメントが機能しなくなりました。創設者とF1動物の両方が、肉の品質に影響を与えることなく、著しく速い成長を示しました。これらの結果は、CRISPR-Cas9テクノロジーを使用してIGF2イントロン3-3072サイトを編集すると、バマ豚の肉生産が改善されたことを示しています。これは、非コード領域を編集することで家畜の経済的特性を改善できることを示す最初のデモンストレーションです。"]
[45,29637228,"animal","pig","CRISPR;Cpf1;"," ","Cellular and molecular life sciences","Engineering CRISPR/Cpf1 with tRNA promotes genome editing capability in mammalian systems.",2018,"75(19):3593-3607","[Wu H et al.]","Joint School of Life Sciences, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Guangzhou Medical University, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, China.",29637228,"10.1007/s00018-018-2810-3 ","CRISPR/Cpf1 features a number of properties that are distinct from CRISPR/Cas9 and provides an excellent alternative to Cas9 for genome editing. To date, genome engineering by CRISPR/Cpf1 has been reported only in human cells and mouse embryos of mammalian systems and its efficiency is ultimately lower than that of  Cas9 proteins from Streptococcus pyogenes. The application of CRISPR/Cpf1 for targeted mutagenesis in other animal models has not been successfully verified. In this study, we designed and optimized a guide RNA (gRNA) transcription system  by inserting a transfer RNA precursor (pre-tRNA) sequence downstream of the gRNA  for Cpf1, protecting gRNA from immediate digestion by 3'-to-5' exonucleases. Using this new gRNA(tRNA) system, genome editing, including indels, large fragment deletion and precise point mutation, was induced in mammalian systems, showing significantly higher efficiency than the original Cpf1-gRNA system. With  this system, gene-modified rabbits and pigs were generated by embryo injection or somatic cell nuclear transfer (SCNT) with an efficiency comparable to that of the Cas9 gRNA system. These results demonstrated that this refined gRNA(tRNA) system  can boost the targeting capability of CRISPR/Cpf1 toolkits.","pig","CRISPR / Cpf1は、CRISPR / Cas9とは異なる多くのプロパティを備えており、ゲノム編集のためにCas9の優れた代替手段を提供します。現在まで、CRISPR / Cpf1によるゲノム工学は、哺乳類システムのヒト細胞とマウス胚でのみ報告されており、その効率は、StreptococcuspyogenesのCas9タンパク質よりも最終的に低くなっています。他の動物モデルにおける標的突然変異誘発のためのCRISPR / Cpf1の適用は首尾よく検証されていません。この研究では、Cpf1のgRNAの下流にトランスファーRNA前駆体（pre-tRNA）配列を挿入することにより、ガイドRNA（gRNA）転写システムを設計および最適化し、3 'から5'のエキソヌクレアーゼによる即時消化からgRNAを保護しました。この新しいgRNA（tRNA）システムを使用して、インデル、大きなフラグメントの削除、正確な点突然変異などのゲノム編集が哺乳類のシステムで誘導され、元のCpf1-gRNAシステムよりも大幅に高い効率を示しました。このシステムでは、Cas9 gRNAシステムと同等の効率で、胚注入または体細胞核移植（SCNT）によって遺伝子改変ウサギおよびブタが生成されました。これらの結果は、この洗練されたgRNA（tRNA）システムがCRISPR / Cpf1ツールキットのターゲティング機能を高めることができることを示しています。"]
[46,29563188,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","fat-1 (inserted);Rosa26","G3","Site-Specific Fat-1 Knock-In Enables Significant Decrease of n-6PUFAs/n-3PUFAs Ratio in Pigs.",2018,"8(5):1747-1754","[Li M et al.]","Jilin University, Changchun, Jilin, China.",29563188,"10.1534/g3.118.200114 ","The fat-1 gene from Caenorhabditis elegans encodes a fatty acid desaturase which  was widely studied due to its beneficial function of converting n-6 polyunsaturated fatty acids (n-6PUFAs) to n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3PUFAs). To date, many fat-1 transgenic animals have been generated to study disease pathogenesis or improve meat quality. However, all of them were generated using a random integration method with variable transgene expression levels and the introduction of selectable marker genes often raise biosafety concern. To this end, we aimed to generate marker-free fat-1 transgenic pigs in a site-specific manner. The Rosa26 locus, first found in mouse embryonic stem cells, has become one of the most common sites for inserting transgenes due to its safe and ubiquitous expression. In our study, the fat-1 gene was inserted into porcine Rosa 26 (pRosa26) locus via Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) system. The Southern blot analysis of our knock-in pigs indicated a single copy of the fat-1 gene at the pRosa26 locus. Furthermore, this single-copy fat-1 gene supported satisfactory expression in a variety of tissues in F1 generation pigs. Importantly, the gas chromatography analysis indicated that these fat-1 knock-in pigs exhibited a significant increase in the level of n-3PUFAs, leading to an obvious decrease in  the n-6PUFAs/n-3PUFAs ratio from 9.36 to 2.12 (***P < 0.0001). Altogether, our fat-1 knock-in pigs hold great promise for improving the nutritional value of pork and serving as an animal model to investigate therapeutic effects of n-3PUFAs on various diseases.","pig","Caenorhabditis elegansのfat-1遺伝子は、n-6多価不飽和脂肪酸（n-6PUFA）をn-3多価不飽和脂肪酸（n-3PUFA）に変換するという有益な機能のために広く研究されている脂肪酸デサチュラーゼをコードしています。現在まで、多くのfat-1トランスジェニック動物が、病気の病因を研究したり、肉の品質を改善したりするために作られてきました。ただし、それらはすべて、導入遺伝子の発現レベルが可変のランダム統合法を使用して生成されたものであり、選択可能なマーカー遺伝子の導入により、バイオセーフティの懸念が生じることがよくあります。この目的のために、我々は、部位特異的な方法でマーカーフリーのfat-1トランスジェニックブタを作製することを目指した。マウス胚性幹細胞で最初に発見されたRosa26遺伝子座は、その安全で遍在的な発現により、導入遺伝子を挿入するための最も一般的な部位の1つになっています。私たちの研究では、fat-1遺伝子はクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連9（Cas9）システムを介してブタRosa 26（pRosa26）遺伝子座に挿入されました。ノックインブタのサザンブロット分析は、pRosa26遺伝子座にfat-1遺伝子の単一コピーを示しました。さらに、このシングルコピーfat-1遺伝子は、F1世代のブタのさまざまな組織で満足のいく発現をサポートしました。重要なことに、ガスクロマトグラフィー分析は、これらのfat-1ノックインブタがn-3PUFAのレベルの有意な増加を示し、9.36から2.12へのn-6PUFA / n-3PUFA比の明らかな減少につながることを示しました（** * P <0.0001）。全体として、私たちのfat-1ノックイン豚は、豚肉の栄養価を改善し、さまざまな病気に対するn-3PUFAの治療効果を調査するための動物モデルとして役立つという大きな期待を抱いています。"]
[47,29899280,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","MYH-7","Genes","Efficient Knock-in of a Point Mutation in Porcine Fibroblasts Using the CRISPR/Cas9-GMNN Fusion Gene.",2018,"9(6)","[Gerlach M et al.]","Hannover Medical School, Hannover, Germany.",29899280,"10.3390/genes9060296 ","During CRISPR/Cas9 mediated genome editing, site-specific double strand breaks are introduced and repaired either unspecific by non-homologous end joining (NHEJ) or sequence dependent by homology directed repair (HDR). Whereas NHEJ-based generation of gene knock-out is widely performed, the HDR-based knock-in of specific mutations remains a bottleneck. Especially in primary cell lines that are essential for the generation of cell culture and animal models of  inherited human diseases, knock-in efficacy is insufficient and needs significant improvement. Here, we tested two different approaches to increase the knock-in frequency of a specific point mutation into the MYH7-gene in porcine fetal fibroblasts. We added a small molecule inhibitor of NHEJ, SCR7 (5,6-bis((E)-benzylideneamino)-2-mercaptopyrimidin-4-ol), during genome editing and screened cell cultures for the point mutation. However, this approach did not yield increased knock-in rates. In an alternative approach, we fused humanized Cas9 (hCas9) to the N-terminal peptide of the Geminin gene (GMNN). The fusion protein is degraded in NHEJ-dominated cell cycle phases, which should increase HDR-rates. Using hCas9-GMNN and point mutation-specific real time PCR screening,  we found a two-fold increase in genome edited cell cultures. This increase of HDR by hCas9-GMNN provides a promising way to enrich specific knock-in in porcine fibroblast cultures for somatic cloning approaches.","pig","CRISPR / Cas9を介したゲノム編集中に、部位特異的な二本鎖切断が導入され、非相同末端結合（NHEJ）によって非特異的に修復されるか、相同性指向修復（HDR）によって配列依存的に修復されます。NHEJベースの遺伝子ノックアウトの生成は広く行われていますが、HDRベースの特定の変異のノックインは依然としてボトルネックです。特に、細胞培養の生成に不可欠な初代細胞株や遺伝性ヒト疾患の動物モデルでは、ノックイン効果が不十分であり、大幅な改善が必要です。ここでは、ブタ胎児線維芽細胞のMYH7遺伝子への特定の点突然変異のノックイン頻度を高めるために2つの異なるアプローチをテストしました。NHEJの小分子阻害剤であるSCR7（5,6-ビス（（E）-ベンジリデンアミノ）-2-メルカプトピリミジン-4-オール）をゲノム編集中に追加し、点突然変異について細胞培養をスクリーニングしました。ただし、このアプローチではノックイン率は増加しませんでした。別のアプローチでは、ヒト化Cas9（hCas9）をジェミニン遺伝子（GMNN）のN末端ペプチドに融合させました。融合タンパク質はNHEJが優勢な細胞周期段階で分解され、HDR率が上昇するはずです。hCas9-GMNNと点突然変異特異的リアルタイムPCRスクリーニングを使用して、ゲノム編集された細胞培養で2倍の増加が見られました。hCas9-GMNNによるHDRのこの増加は、体細胞クローニングアプローチのためのブタ線維芽細胞培養における特定のノックインを強化するための有望な方法を提供します。"]
[48,30007952,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","GGTA1; CMAH; beta 4GaINT2","Journal of biomedical research","Antigenicity of tissues and organs from GGTA1/CMAH/beta4GalNT2 triple gene knockout pigs.",2018,null,"[Wang RG et al.]","Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu, China.",30007952,"10.7555/JBR.32.20180018 ","Clinical xenotransplantations have been hampered by human preformed antibody-mediated damage of the xenografts. To overcome biological incompatibility between pigs and humans, one strategy is to remove the major antigens [Gal, Neu5Gc, and Sd(a)] present on pig cells and tissues. Triple gene (GGTA1, CMAH, and beta 4GalNT2) knockout (TKO) pigs were produced in our laboratory by CRISPR-Cas9 targeting. To investigate the antigenicity reduction in the TKO pigs, the expression levels of these three xenoantigens in the cornea, heart, liver, spleen, lung, kidney, and pancreas tissues were examined. The level of human IgG/IgM binding to those tissues was also investigated, with wildtype pig tissues as control. The results showed that alphaGal, Neu5Gc, and Sd(a) were  markedly positive in all the examined tissues in wildtype pigs but barely detected in TKO pigs. Compared to wildtype pigs, the liver, spleen, and pancreas  of TKO pigs showed comparable levels of human IgG and IgM binding, whereas corneas, heart, lung, and kidney of TKO pigs exhibited significantly reduced human IgG and IgM binding. These results indicate that the antigenicity of TKO pig is significantly reduced and the remaining xenoantigens on porcine tissues can be eliminated via a gene targeting approach.","pig","臨床異種移植は、異種移植片のヒトで事前に形成された抗体媒介性損傷によって妨げられてきた。ブタとヒトの間の生物学的不適合性を克服するための1つの戦略は、ブタの細胞および組織に存在する主要な抗原[Gal、Neu5Gc、およびSd（a）]を除去することです。トリプル遺伝子（GGTA1、CMAH、およびベータ4GalNT2）ノックアウト（TKO）ブタは、CRISPR-Cas9ターゲティングによって私たちの研究室で生産されました。TKOブタの抗原性低下を調査するために、角膜、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、および膵臓組織におけるこれら3つの異種抗原の発現レベルを調べました。これらの組織に結合するヒトIgG / IgMのレベルも、野生型ブタ組織を対照として調査しました。結果は、alphaGal、Neu5Gc、およびSd（a）が野生型ブタのすべての検査組織で著しく陽性であったが、TKOブタではほとんど検出されなかったことを示しました。野生型ブタと比較して、TKOブタの肝臓、脾臓、および膵臓は、同等レベルのヒトIgGおよびIgM結合を示したが、TKOブタの角膜、心臓、肺、および腎臓は、有意に減少したヒトIgGおよびIgM結合を示した。これらの結果は、TKOブタの抗原性が大幅に低下し、ブタ組織に残っている異種抗原を遺伝子ターゲティングアプローチによって排除できることを示しています。"]
[49,29058795,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","fatty acid synthase","Journal of cellular physiology","Fatty acid synthase knockout impairs early embryonic development via induction of endoplasmic reticulum stress in pigs.",2018,"233(5):4225-4234","[Guo J et al.]","Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk,  Korea.",29058795,"10.1002/jcp.26241 ","Fatty acid synthase (FAS) is an important enzyme involved in the de novo synthesis of long-chain fatty acids. During development, the function of FAS in growth is greater than that in energy storage pathways; therefore, we hypothesized that knockout of FAS would affect early embryonic development owing  to the induction of endoplasmic reticulum (ER) stress. In the present study, the  function of FAS was studied using the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/ CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system. Cas9 and single-guide RNA (sgRNA) were injected into parthenotes to decrease the number of FAS-positive embryos. The efficiency of knockout was assayed by DNA sequencing. We found that FAS knockout caused excessive production of reactive oxygen species (ROS). Excess ROS induced ER stress, resulting in activation of the adaptive unfolded protein response (UPR). FAS knockout caused splicing of the X-box binding protein 1 gene (XBP1) and expression of spliced XBP1 mRNA. In addition, FAS knockout caused phosphorylation of PKR-like ER kinase (PERK), and an increase in the mRNA expression of the ER stress-regulated genes, activating transcription factor 4 (ATF4), and C/EBP homologous protein (CHOP). Finally, Ca(2+) was released from the ER and taken up by the mitochondria. As the ER stress became intolerable, apoptosis was initiated. These results demonstrate that FAS knockout induced ROS generation, which mediated the activation of UPR via the ER stress, ultimately leading to apoptosis induction.","pig","脂肪酸シンターゼ（FAS）は、長鎖脂肪酸のdenovo合成に関与する重要な酵素です。開発中、成長におけるFASの機能は、エネルギー貯蔵経路における機能よりも大きくなります。したがって、FASのノックアウトは、小胞体（ER）ストレスの誘導により、初期胚発生に影響を与えると仮定しました。本研究では、CRISPR（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）システムを使用してFASの機能を研究しました。Cas9とシングルガイドRNA（sgRNA）をパルテノートに注入して、FAS陽性胚の数を減らしました。ノックアウトの効率は、DNAシーケンシングによって分析されました。FASノックアウトが活性酸素種（ROS）の過剰産生を引き起こすことがわかりました。過剰なROSはERストレスを誘発し、適応型の折りたたまれていないタンパク質応答（UPR）の活性化をもたらしました。FASノックアウトはX-box結合タンパク質1遺伝子（XBP1）のスプライシングとスプライシングされたXBP1mRNAの発現を引き起こしました。さらに、FASノックアウトはPKR様ERキナーゼ（PERK）のリン酸化、およびERストレス調節遺伝子のmRNA発現の増加、転写因子4（ATF4）、およびC / EBP相同タンパク質（CHOP）の活性化を引き起こしました。最後に、Ca（2+）がERから放出され、ミトコンドリアに取り込まれました。小胞体ストレスが耐えられなくなると、アポトーシスが始まりました。これらの結果は、FASノックアウトがROS生成を誘導し、これがERストレスを介してUPRの活性化を媒介し、最終的にアポトーシス誘導を引き起こすことを示しています。"]
[50,29937002,"animal","pig","Cas9;","thrombomodulin","Journal of surgical research","CRISPR/Cas and recombinase-based human-to-pig orthotopic gene exchange for xenotransplantation.",2018,"229:28-40","[Nunes Dos Santos RM et al.]","Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN, USA.",29937002,"10.1016/j.jss.2018.03.051 ","BACKGROUND: Tools for genome editing in pigs are improving rapidly so that making precise cuts in DNA for the purposes of deleting genes is straightforward. Development of means to replace pig genes with human genes with precision is very desirable for the future development of donor pigs for xenotransplantation. MATERIALS AND METHODS: We used Cas9 to cut pig thrombomodulin (pTHBD) and replace it with a plasmid containing a promoterless antibiotic selection marker and the exon for human thrombomodulin. PhiC31 recombinase was used to remove the antibiotic selection marker to create porcine aortic endothelial cells expressing human instead of pTHBD, driven by the endogenous pig promoter. RESULTS: The promoterless selection cassette permitted efficient enrichment of cells containing correctly inserted transgene. Recombinase treatment of selected cells  excised the resistance marker permitting expression of the human transgene by the endogenous pTHBD promoter. Gene regulation was maintained after gene replacement  because pig endogenous promoter was kept intact in the correct position. CONCLUSIONS: Cas9 and recombinase technology make orthotopic human for pig gene exchange feasible and pave the way for creation of pigs with human genes that can be expressed in the appropriate tissues preserving gene regulation.","pig","背景：ブタのゲノム編集ツールは急速に進歩しているため、遺伝子を削除する目的でDNAを正確にカットするのは簡単です。ブタの遺伝子をヒトの遺伝子に正確に置き換える手段の開発は、異種移植のためのドナーブタの将来の開発にとって非常に望ましい。材料と方法：Cas9を使用してブタのトロンボモジュリン（pTHBD）を切断し、プロモーターのない抗生物質選択マーカーとヒトトロンボモジュリンのエクソンを含むプラスミドに置き換えました。PhiC31リコンビナーゼを使用して抗生物質選択マーカーを除去し、内因性ブタプロモーターによって駆動されるpTHBDの代わりにヒトを発現するブタ大動脈内皮細胞を作成しました。結果：プロモーターのない選択カセットは、正しく挿入された導入遺伝子を含む細胞の効率的な濃縮を可能にしました。選択された細胞のリコンビナーゼ処理は、内因性pTHBDプロモーターによるヒト導入遺伝子の発現を可能にする耐性マーカーを切除した。ブタの内因性プロモーターは無傷で正しい位置に保たれていたため、遺伝子置換後も遺伝子調節は維持されていました。結論：Cas9とリコンビナーゼ技術は、ブタの遺伝子交換のための同所性ヒトを実現可能にし、遺伝子調節を維持する適切な組織で発現できるヒト遺伝子を持つブタの作成への道を開きます。"]
[51,29482569,"animal","pig","Cas9;","growth hormone receptor (GHR)","Journal of translational medicine","Generation of GHR-modified pigs as Laron syndrome models via a dual-sgRNAs/Cas9 system and somatic cell nuclear transfer.",2018,"16(1):41","[Yu H et al.]","ShanghaiTech University, Shanghai, China.",29482569,"10.1186/s12967-018-1409-7 ","BACKGROUND: Laron syndrome is an autosomal disease resulting from mutations in the growth hormone receptor (GHR) gene. The only therapeutic treatment for Laron  syndrome is recombinant insulin-like growth factor I (IGF-I), which has been shown to have various side effects. The improved Laron syndrome models are important for better understanding the pathogenesis of the disease and developing corresponding therapeutics. Pigs have become attractive biomedical models for human condition due to similarities in anatomy, physiology, and metabolism relative to humans, which could serve as an appropriate model for Laron syndrome. METHODS: To further improve the GHR knockout (GHRKO) efficiency and explore the feasibility of precise DNA deletion at targeted sites, the dual-sgRNAs/Cas9 system was designed to target GHR exon 3 in pig fetal fibroblasts (PFFs). The vectors encoding sgRNAs and Cas9 were co-transfected into PFFs by electroporation and GHRKO cell lines were established by single cell cloning culture. Two biallelic knockout cell lines were selected as the donor cell line for somatic cell nuclear transfer for the generation of GHRKO pigs. The genotype of colonies, cloned fetuses and piglets were identified by T7 endonuclease I (T7ENI) assay and sequencing. The GHR expression in the fibroblasts and piglets was analyzed by confocal microscopy, quantitative polymerase chain reaction (q-PCR), western blotting (WB) and immunohistochemical (IHC) staining. The phenotype of GHRKO pigs was recapitulated through level detection of IGF-I and glucose, and measurement of body weight and body size. GHRKO F1 generation were generated by crossing with wild-type pigs, and their genotype was detected by T7ENI assay and sequencing. GHRKO F2 generation was obtained via self-cross of GHRKO F1 pigs. Their genotypes of GHRKO F2 generation was also detected by Sanger sequencing. RESULTS: In total, 19 of 20 single-cell colonies exhibited biallelic modified GHR (95%), and the efficiency of DNA deletion mediated by dual-sgRNAs/Cas9 was as high as 90% in 40  GHR alleles of 20 single-cell colonies. Two types of GHR allelic single-cell colonies (GHR(-47/-1), GHR(-47/-46)) were selected as donor cells for the generation of GHRKO pigs. The reconstructed embryos were transferred into 15 recipient gilts, resulting in 15 GHRKO newborn piglets and 2 fetuses. The GHRKO pigs exhibited slow growth rates and small body sizes. From birth to 13 months old, the average body weight of wild-type pigs varied from 0.6 to 89.5 kg, but that of GHRKO pigs varied from only 0.9 to 37.0 kg. Biochemically, the knockout pigs exhibited decreased serum levels of IGF-I and glucose. Furthermore, the GHRKO pigs had normal reproduction ability, as eighteen GHRKO F1 piglets were obtained via mating a GHRKO pig with wild-type pigs and five GHRKO F2 piglets were obtained by self-cross of F1 generation, indicating that modified GHR alleles can pass to the next generation via germline transmission. CONCLUSION: The dual-sgRNAs/Cas9 is a reliable system for DNA deletion and that GHRKO pigs conform to typical phenotypes of those observed in Laron patients, suggesting that these pigs could serve as an appropriate model for Laron syndrome.","pig","背景：ラロン症候群は、成長ホルモン受容体（GHR）遺伝子の変異に起因する常染色体疾患です。ラロン症候群の唯一の治療法は、さまざまな副作用があることが示されている組換えインスリン様成長因子I（IGF-I）です。改善されたラロン症候群モデルは、疾患の病因をよりよく理解し、対応する治療法を開発するために重要です。ブタは、人間と比較して解剖学、生理学、代謝が類似しているため、人間の状態の魅力的な生物医学モデルになりました。これは、ラロン症候群の適切なモデルとして役立つ可能性があります。方法：GHRノックアウト（GHRKO）の効率をさらに改善し、標的部位での正確なDNA欠失の実現可能性を探るために、デュアルsgRNA / Cas9システムはブタ胎児線維芽細胞（PFF）のGHRエクソン3を標的とするように設計されました。sgRNAとCas9をコードするベクターをエレクトロポレーションによってPFFにコトランスフェクトし、GHRKO細胞株を単一細胞クローニング培養によって樹立しました。GHRKOブタの生成のための体細胞核移植のためのドナー細胞株として2つの二対立遺伝子ノックアウト細胞株が選択された。コロニー、クローン化された胎児および子豚の遺伝子型は、T7エンドヌクレアーゼI（T7ENI）アッセイおよび配列決定によって同定されました。線維芽細胞と子豚のGHR発現は、共焦点顕微鏡、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（q-PCR）、ウエスタンブロッティング（WB）、免疫組織化学（IHC）染色によって分析されました。GHRKO豚の表現型は、IGF-Iとブドウ糖のレベル検出、および体重と体の大きさの測定を通じて再現されました。GHRKO F1の生成は、野生型のブタと交配することによって生成され、それらの遺伝子型はT7ENIアッセイとシーケンシングによって検出されました。GHRKO F2の生成は、GHRKOF1豚の自己交配によって得られました。GHRKO F2世代のそれらの遺伝子型は、サンガーシーケンシングによっても検出されました。結果：合計で、20個の単一細胞コロニーのうち19個が二対立遺伝子修飾GHR（95％）を示し、デュアルsgRNA / Cas9によって媒介されるDNA欠失の効率は、20個の単一細胞コロニーの40個のGHR対立遺伝子で90％と高かった。 。2種類のGHR対立遺伝子単一細胞コロニー（GHR（-47 / -1）、GHR（-47 / -46））が、GHRKOブタの生成のためのドナー細胞として選択されました。再構築された胚は15頭のレシピエント雌ブタに移植され、15頭のGHRKO新生子豚と2頭の胎児が生まれました。GHRKO豚は、成長速度が遅く、体のサイズが小さいことを示しました。生後13か月まで、野生型豚の平均体重は0.6〜89.5 kgでしたが、GHRKO豚の平均体重はわずか0.9〜37.0kgでした。生化学的に、ノックアウトブタはIGF-Iとグルコースの血清レベルの低下を示した。さらに、ＧＨＲＫＯ豚と野生型豚を交配させることにより１８頭のＧＨＲＫＯ Ｆ１子豚が得られ、Ｆ１世代の自己交雑により５頭のＧＨＲＫＯ Ｆ２子豚が得られたことから、ＧＨＲＫＯ豚は正常な繁殖能力を有し、改変ＧＨＲ対立遺伝子が生殖細胞伝達を介した次世代。結論：dual-sgRNAs / Cas9はDNA欠失の信頼できるシステムであり、GHRKO豚はラロン患者で観察された典型的な表現型に一致しており、これらの豚がラロン症候群の適切なモデルとして役立つ可能性があることを示唆しています。"]
[52,30111571,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","immunoglobulin heavy chain JH","Journal of virology","Infection Dynamics of Hepatitis E Virus in Wild-Type and Immunoglobulin Heavy Chain Knockout JH (-/-) Gnotobiotic Piglets.",2018,"92(21)","[Yugo DM et al.]","Virginia-Maryland College of  Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, USA.",30111571,"10.1128/JVI.01208-18 ","Hepatitis E virus (HEV), the causative agent of hepatitis E, is an important but  incompletely understood pathogen causing high mortality during pregnancy and leading to chronic hepatitis in immunocompromised individuals. The underlying mechanisms leading to hepatic damage remain unknown; however, the humoral immune  response is implicated. In this study, immunoglobulin (Ig) heavy chain JH (-/-) knockout gnotobiotic pigs were generated using CRISPR/Cas9 technology to deplete  the B-lymphocyte population, resulting in an inability to generate a humoral immune response to genotype 3 HEV infection. Compared to wild-type gnotobiotic piglets, the frequencies of B lymphocytes in the Ig heavy chain JH (-/-) knockouts were significantly lower, despite similar levels of other innate and adaptive T-lymphocyte cell populations. The dynamic of acute HEV infection was subsequently determined in heavy chain JH (-/-) knockout and wild-type gnotobiotic pigs. The data showed that wild-type piglets had higher viral RNA loads in feces and sera compared to the JH (-/-) knockout pigs, suggesting that the Ig heavy chain JH (-/-) knockout in pigs actually decreased the level of HEV  replication. Both HEV-infected wild-type and JH (-/-) knockout gnotobiotic piglets developed more pronounced lymphoplasmacytic hepatitis and hepatocellular  necrosis lesions than other studies with conventional pigs. The HEV-infected JH (-/-) knockout pigs also had significantly enlarged livers both grossly and as a  ratio of liver/body weight compared to phosphate-buffered saline-inoculated groups. This novel gnotobiotic pig model will aid in future studies into HEV pathogenicity, an aspect which has thus far been difficult to reproduce in the available animal model systems.IMPORTANCE According to the World Health Organization, approximately 20 million HEV infections occur annually, resulting in 3.3 million cases of hepatitis E and >44,000 deaths. The lack of an efficient  animal model that can mimic the full-spectrum of infection outcomes hinders our ability to delineate the mechanism of HEV pathogenesis. Here, we successfully generated immunoglobulin heavy chain JH (-/-) knockout gnotobiotic pigs using CRISPR/Cas9 technology, established a novel JH (-/-) knockout and wild-type gnotobiotic pig model for HEV, and systematically determined the dynamic of acute HEV infection in gnotobiotic pigs. It was demonstrated that knockout of the Ig heavy chain in pigs decreased the level of HEV replication. Infected wild-type and JH (-/-) knockout gnotobiotic piglets developed more pronounced HEV-specific  lesions than other studies using conventional pigs, and the infected JH (-/-) knockout pigs had significantly enlarged livers. The availability of this novel model will facilitate future studies of HEV pathogenicity.","pig","E型肝炎の原因物質であるE型肝炎ウイルス（HEV）は重要ですが、完全には理解されていない病原体であり、妊娠中に高い死亡率を引き起こし、免疫不全の人に慢性肝炎を引き起こします。肝障害につながる根本的なメカニズムは不明のままです。ただし、体液性免疫応答が関係しています。この研究では、免疫グロブリン（Ig）重鎖JH（-/-）ノックアウトノトバイオートブタがCRISPR / Cas9テクノロジーを使用して生成され、Bリンパ球集団が枯渇し、遺伝子型3HEV感染に対する体液性免疫応答を生成できなくなりました。野生型ノトバイオート子豚と比較して、Ig重鎖JH（-/-）ノックアウトにおけるBリンパ球の頻度は、他の先天性および適応性Tリンパ球細胞集団と同様のレベルにもかかわらず、有意に低かった。その後、急性HEV感染の動態は、重鎖JH（-/-）ノックアウトおよび野生型ノックアウトブタで測定されました。データは、野生型子豚がJH（-/-）ノックアウト豚と比較して糞便および血清中のウイルスRNA負荷が高いことを示し、豚のIg重鎖JH（-/-）ノックアウトが実際にHEVのレベルを低下させたことを示唆しています複製。HEVに感染した野生型とJH（-/-）ノックアウトノトバイオティック子豚はどちらも、従来のブタを用いた他の研究よりも顕著なリンパ形質細胞性肝炎と肝細胞壊死病変を発症しました。HEVに感染したJH（-/-）ノックアウト豚は、リン酸緩衝生理食塩水を接種したグループと比較して、肝臓が全体的にも肝臓/体重の比率としても有意に拡大していました。この新しいノトバイオティックブタモデルは、利用可能な動物モデルシステムではこれまで再現が困難であったHEV病原性の将来の研究に役立ちます。重要世界保健機関によると、年間約2,000万件のHEV感染が発生し、結果として3.3になります。 E型肝炎の100万例と44,000人以上の死亡。感染の結果の全範囲を模倣できる効率的な動物モデルの欠如は、HEVの病因のメカニズムを描写する私たちの能力を妨げます。ここでは、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して免疫グロブリン重鎖JH（-/-）ノックアウトノックアウトブタの生成に成功し、HEV用の新しいJH（-/-）ノックアウトおよび野生型ノックアウトブタモデルを確立し、急性のダイナミクスを体系的に決定しましたノックアウトブタにおけるHEV感染。ブタのIg重鎖のノックアウトは、HEV複製のレベルを低下させることが実証されました。感染した野生型およびJH（-/-）ノックアウトノックアウト子豚は、従来のブタを使用した他の研究よりも顕著なHEV特異的病変を発症し、感染したJH（-/-）ノックアウトブタは肝臓が著しく肥大した。この新しいモデルの可用性は、HEVの病原性の将来の研究を容易にします。"]
[53,29925651,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","CD163","Journal of virology","Pigs Lacking the Scavenger Receptor Cysteine-Rich Domain 5 of CD163 Are Resistant to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus 1 Infection.",2018,"92(16)","[Burkard C  et al.]","University of Edinburgh, Midlothian, UK.",29925651,"10.1128/JVI.00415-18 ","Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) has a narrow host cell tropism, limited to cells of the monocyte/macrophage lineage. CD163 protein  is expressed at high levels on the surface of specific macrophage types, and a soluble form is circulating in blood. CD163 has been described as a fusion receptor for PRRSV, with the scavenger receptor cysteine-rich domain 5 (SRCR5) region having been shown to be the interaction site for the virus. As reported previously, we have generated pigs in which exon 7 of the CD163 gene has been deleted using CRISPR/Cas9 editing in pig zygotes. These pigs express CD163 protein lacking SRCR5 (DeltaSRCR5 CD163) and show no adverse effects when maintained under standard husbandry conditions. Not only was DeltaSRCR5 CD163 detected on the surface of macrophage subsets, but the secreted, soluble protein  can also be detected in the serum of the edited pigs, as shown here by a porcine  soluble CD163-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Previous results showed that primary macrophage cells from DeltaSRCR5 CD163 animals are resistant to PRRSV-1 subtype 1, 2, and 3 as well as PRRSV-2 infection in vitro Here, DeltaSRCR5 pigs were challenged with a highly virulent PRRSV-1 subtype 2 strain. In contrast to the wild-type control group, DeltaSRCR5 pigs showed no signs of infection and no viremia or antibody response indicative of a productive infection. Histopathological analysis of lung and lymph node tissue showed no presence of virus-replicating cells in either tissue. This shows that DeltaSRCR5  pigs are fully resistant to infection by the virus.IMPORTANCE Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus (PRRSV) is the etiological agent of PRRS, causing late-term abortions, stillbirths, and respiratory disease  in pigs, incurring major economic losses to the worldwide pig industry. The virus is highly mutagenic and can be divided into two species, PRRSV-1 and PRRSV-2, each containing several subtypes. Current control strategies mainly involve biosecurity measures, depopulation, and vaccination. Vaccines are at best only partially protective against infection with heterologous subtypes and sublineages, and modified live vaccines have frequently been reported to revert to virulence. Here, we demonstrate that a genetic-control approach results in complete resistance to PRRSV infection in vivo CD163 is edited so as to remove the viral interaction domain while maintaining protein expression and biological  function, averting any potential adverse effect associated with protein knockout. This research demonstrates a genetic-control approach with potential benefits in  animal welfare as well as to the pork industry.","pig","豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）は、単球/マクロファージ系統の細胞に限定された狭い宿主細胞指向性を持っています。CD163タンパク質は特定のマクロファージタイプの表面に高レベルで発現しており、可溶型が血中を循環しています。CD163はPRRSVの融合受容体として説明されており、スカベンジャー受容体のシステインリッチドメイン5（SRCR5）領域がウイルスの相互作用部位であることが示されています。以前に報告されたように、CD163遺伝子のエクソン7がブタ接合子でCRISPR / Cas9編集を使用して削除されたブタを生成しました。これらのブタは、SRCR5を欠くCD163タンパク質（DeltaSRCR5 CD163）を発現し、標準的な畜産条件下で維持された場合に悪影響を示しません。DeltaSRCR5 CD163はマクロファージサブセットの表面で検出されただけでなく、分泌された可溶性タンパク質は、ブタの可溶性CD163特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）で示されているように、編集されたブタの血清でも検出できます。以前の結果は、DeltaSRCR5 CD163動物の初代マクロファージ細胞がPRRSV-1サブタイプ1、2、3、およびin vitroでのPRRSV-2感染に耐性があることを示しました。ここでは、DeltaSRCR5ブタに非常に毒性の高いPRRSV-1サブタイプ2株を投与しました。野生型対照群とは対照的に、DeltaSRCR5ブタは感染の兆候を示さず、ウイルス血症または増殖性感染を示す抗体反応も示さなかった。肺およびリンパ節組織の組織病理学的分析は、どちらの組織にもウイルス複製細胞の存在を示さなかった。これは、DeltaSRCR5豚がウイルスによる感染に完全に耐性があることを示しています。重要豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）ウイルス（PRRSV）は、PRRSの病因であり、豚に後期流産、死産、呼吸器疾患を引き起こし、主要な病気を引き起こします。世界の豚産業への経済的損失。このウイルスは変異原性が高く、PRRSV-1とPRRSV-2の2つの種に分けることができ、それぞれにいくつかのサブタイプが含まれています。現在の管理戦略には、主にバイオセキュリティ対策、過疎化、およびワクチン接種が含まれます。ワクチンはせいぜい異種のサブタイプおよびサブリネージによる感染に対して部分的にしか防御できず、改変された生ワクチンは病原性に戻ることが頻繁に報告されています。ここでは、遺伝子制御アプローチがin vivoでのPRRSV感染に対する完全な耐性をもたらすことを示します。CD163は、タンパク質の発現と生物学的機能を維持しながらウイルス相互作用ドメインを除去し、タンパク質のノックアウトに関連する潜在的な悪影響を回避するように編集されます。この研究は、動物福祉と豚肉産業に潜在的な利益をもたらす遺伝的制御アプローチを示しています。"]
[54,29678421,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","growth hormone receptor","Molecular metabolism","Growth hormone receptor-deficient pigs resemble the pathophysiology of human Laron syndrome and reveal altered activation of signaling cascades in the liver.",2018,"11:113-128","[Hinrichs A et al.]","LMU Munich, Munich, Germany.",29678421,"10.1016/j.molmet.2018.03.006 ","OBJECTIVE: Laron syndrome (LS) is a rare, autosomal recessive disorder in humans  caused by loss-of-function mutations of the growth hormone receptor (GHR) gene. To establish a large animal model for LS, pigs with GHR knockout (KO) mutations were generated and characterized. METHODS: CRISPR/Cas9 technology was applied to  mutate exon 3 of the GHR gene in porcine zygotes. Two heterozygous founder sows with a 1-bp or 7-bp insertion in GHR exon 3 were obtained, and their heterozygous F1 offspring were intercrossed to produce GHR-KO, heterozygous GHR mutant, and wild-type pigs. Since the latter two groups were not significantly different in any parameter investigated, they were pooled as the GHR expressing control group. The characterization program included body and organ growth, body composition, endocrine and clinical-chemical parameters, as well as signaling studies in liver tissue. RESULTS: GHR-KO pigs lacked GHR and had markedly reduced serum insulin-like growth factor 1 (IGF1) levels and reduced IGF-binding protein 3 (IGFBP3) activity but increased IGFBP2 levels. Serum GH concentrations were significantly elevated compared with control pigs. GHR-KO pigs had a normal birth weight. Growth retardation became significant at the age of five weeks. At the age of six months, the body weight of GHR-KO pigs was reduced by 60% compared with controls. Most organ weights of GHR-KO pigs were reduced proportionally to body weight. However, the weights of liver, kidneys, and heart were disproportionately reduced, while the relative brain weight was almost doubled. GHR-KO pigs had a markedly increased percentage of total body fat relative to body weight and displayed transient juvenile hypoglycemia along with decreased serum triglyceride and cholesterol levels. Analysis of insulin receptor related signaling in the liver of adult fasted pigs revealed increased phosphorylation of IRS1 and PI3K. In agreement with the loss of GHR, phosphorylation of STAT5 was significantly reduced. In contrast, phosphorylation of JAK2 was significantly increased, possibly due to the increased serum leptin levels and increased hepatic leptin receptor expression and activation in GHR-KO pigs. In addition, increased mTOR phosphorylation was observed in GHR-KO liver samples, and phosphorylation studies of downstream substrates suggested the activation of mainly mTOR complex 2. CONCLUSION: GHR-KO pigs resemble the pathophysiology of LS and are an interesting model for mechanistic studies and treatment trials.","pig","目的：ラロン症候群（LS）は、成長ホルモン受容体（GHR）遺伝子の機能喪失型変異によって引き起こされる、ヒトにおけるまれな常染色体劣性疾患です。LSの大型動物モデルを確立するために、GHRノックアウト（KO）変異を持つブタを作成し、特性を明らかにしました。方法：CRISPR / Cas9テクノロジーを適用して、ブタの接合子のGHR遺伝子のエクソン3を変異させました。GHRエクソン3に1bpまたは7bpが挿入された2つのヘテロ接合性創始者雌ブタを取得し、それらのヘテロ接合性F1子孫を交配して、GHR-KO、ヘテロ接合性GHR変異体、および野生型ブタを作製しました。後者の2つのグループは、調査したどのパラメーターでも有意差がなかったため、GHR発現対照グループとしてプールしました。特性評価プログラムには、体と臓​​器の成長、体組成、内分泌および臨床化学的パラメーター、ならびに肝臓組織におけるシグナル伝達研究が含まれていました。結果：GHR-KO豚はGHRを欠き、血清インスリン様成長因子1（IGF1）レベルを著しく低下させ、IGF結合タンパク質3（IGFBP3）活性を低下させたが、IGFBP2レベルを上昇させた。血清GH濃度は、対照ブタと比較して有意に上昇した。GHR-KO豚の出生時体重は正常でした。発育遅延は5週齢で顕著になりました。6ヶ月齢で、GHR-KO豚の体重は対照と比較して60％減少しました。GHR-KO豚のほとんどの臓器重量は、体重に比例して減少しました。しかし、肝臓、腎臓、心臓の重量は不釣り合いに減少し、相対的な脳の重量はほぼ2倍になりました。GHR-KO豚は、体重に比べて総体脂肪の割合が著しく増加し、血清トリグリセリドとコレステロールレベルの低下とともに一過性の若年性低血糖を示しました。成体の絶食したブタの肝臓におけるインスリン受容体関連のシグナル伝達の分析は、IRS1およびPI3Kのリン酸化の増加を明らかにした。GHRの喪失と一致して、STAT5のリン酸化は大幅に減少しました。対照的に、JAK2のリン酸化は、おそらくGHR-KOブタにおける血清レプチンレベルの増加と肝臓レプチン受容体の発現および活性化の増加により、有意に増加しました。さらに、mTORリン酸化の増加がGHR-KO肝臓サンプルで観察され、下流基質のリン酸化研究は主にmTOR複合体2の活性化を示唆しました。結論：GHR-KO豚はLSの病態生理学に似ており、機構研究の興味深いモデルです。治療試験。"]
[55,29393557,"animal","pig","TALENs;","DMD","Molecular reproduction and development","TALEN-mediated gene targeting in porcine spermatogonia.",2018,"85(3):250-261","[Tang L et al.]","University of Calgary, Calgary, Canada.",29393557,"10.1002/mrd.22961 ","Spermatogonia represent a diploid germ cell population that includes spermatogonial stem cells. In this report, we describe new methods for isolation  of highly enriched porcine spermatogonia based on light scatter properties, and for targeted mutagenesis in porcine spermatogonia using nucleofection and TALENs. We optimized a nucleofection protocol to deliver TALENs specifically targeting the DMD locus in porcine spermatogonia. We also validated specific sorting of porcine spermatogonia based on light scatter properties. We were able to obtain a highly enriched germ cell population with over 90% of cells being UCH-L1 positive undifferentiated spermatogonia. After gene targeting in porcine spermatogonia, indel (insertion or deletion) mutations as a result of non-homologous end joining (NHEJ) were detected in up to 18% of transfected cells. Our report demonstrates for the first time an approach to obtain a live cell population highly enriched in undifferentiated spermatogonia from immature porcine testes, and that gene targeting can be achieved in porcine spermatogonia which will enable germ line modification.","pig","精原細胞は、精原細胞を含む二倍体生殖細胞集団を表します。このレポートでは、光散乱特性に基づいて高度に濃縮されたブタ精原細胞を分離するための新しい方法、およびヌクレオフェクションとTALENを使用したブタ精原細胞の標的突然変異誘発について説明します。ブタ精原細胞のDMD遺伝子座を特異的に標的とするTALENを送達するために、ヌクレオフェクションプロトコルを最適化しました。また、光散乱特性に基づいて、ブタ精原細胞の特定の分類を検証しました。細胞の90％以上がUCH-L1陽性の未分化精原細胞である高度に濃縮された生殖細胞集団を得ることができました。ブタ精原細胞で遺伝子ターゲティングを行った後、非相同末端結合（NHEJ）の結果としてのインデル（挿入または欠失）変異が、トランスフェクトされた細胞の最大18％で検出されました。私たちのレポートは、未成熟なブタ精巣から未分化精原細胞が高度に濃縮された生細胞集団を取得するアプローチを初めて示し、遺伝子ターゲティングはブタ精原細胞で達成でき、生殖細胞系列の改変を可能にします。"]
[56,30379811,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","Synaptogyrin-2 (SYNGR2)","PLoS genetics","Synaptogyrin-2 influences replication of Porcine circovirus 2.",2018,"14(10):e1007750","[Walker LR et al.]","University of Nebraska, Lincoln, NE, USA.",30379811,"10.1371/journal.pgen.1007750 ","Porcine circovirus 2 (PCV2) is a circular single-stranded DNA virus responsible for a group of diseases collectively known as PCV2 Associated Diseases (PCVAD). Variation in the incidence and severity of PCVAD exists between pigs suggesting a host genetic component involved in pathogenesis. A large-scale genome-wide association study of experimentally infected pigs (n = 974), provided evidence of a host genetic role in PCV2 viremia, immune response and growth during challenge. Host genotype explained 64% of the phenotypic variation for overall viral load, with two major Quantitative Trait Loci (QTL) identified on chromosome 7 (SSC7) near the swine leukocyte antigen complex class II locus and on the proximal end of chromosome 12 (SSC12). The SNP having the strongest association, ALGA0110477 (SSC12), explained 9.3% of the genetic and 6.2% of the phenotypic variance for viral load. Dissection of the SSC12 QTL based on gene annotation, genomic and RNA-sequencing, suggested that a missense mutation in the SYNGR2 (SYNGR2 p.Arg63Cys) gene is potentially responsible for the variation in viremia. This polymorphism, located within a protein domain conserved across mammals, results in an amino acid variant SYNGR2 p.63Cys only observed in swine. PCV2 titer in PK15 cells decreased when the expression of SYNGR2 was silenced by specific-siRNA, indicating a role of SYNGR2 in viral replication. Additionally, a PK15 edited clone generated by CRISPR-Cas9, carrying a partial deletion of the second exon that harbors a key domain and the SYNGR2 p.Arg63Cys, was associated with a lower viral titer compared to wildtype PK15 cells (>24 hpi) and supernatant (>48hpi)(P < 0.05). Identification of a non-conservative substitution in this key domain of SYNGR2 suggests that the SYNGR2 p.Arg63Cys variant may underlie the observed genetic effect on viral load.","pig","ブタサーコウイルス2（PCV2）は、PCV2関連疾患（PCVAD）として総称される一群の疾患の原因となる環状一本鎖DNAウイルスです。PCVADの発生率と重症度にはブタ間でばらつきがあり、病因に関与する宿主の遺伝的要素を示唆しています。実験的に感染したブタ（n = 974）の大規模なゲノムワイド関連研究は、PCV2ウイルス血症、免疫応答、およびチャレンジ中の成長における宿主の遺伝的役割の証拠を提供しました。宿主の遺伝子型は、ウイルス量全体の表現型の変動の64％を説明し、2つの主要な量的形質遺伝子座（QTL）が、ブタ白血球抗原複合体クラスII遺伝子座の近くの7番染色体（SSC7）と12番染色体の近位端（SSC12）で同定されました。 。最も強い関連性を持つSNP、ALGA0110477（SSC12）は、ウイルス量の遺伝的分散の9.3％および表現型分散の6.2％を説明しました。遺伝子注釈、ゲノムおよびRNAシーケンスに基づくSSC12 QTLの分析は、SYNGR2（SYNGR2 p.Arg63Cys）遺伝子のミスセンス変異がウイルス血症の変動の原因である可能性があることを示唆しました。哺乳類全体で保存されているタンパク質ドメイン内に位置するこの多型は、ブタでのみ観察されるアミノ酸変異体SYNGR2p.63Cysをもたらします。PK15細胞のPCV2力価は、SYNGR2の発現が特定のsiRNAによってサイレンシングされると減少し、ウイルス複製におけるSYNGR2の役割を示しています。さらに、CRISPR-Cas9によって生成されたPK15編集クローンは、キードメインとSYNGR2 p.Arg63Cysを含む2番目のエクソンの部分的な欠失を持ち、野生型PK15細胞（> 24 hpi）と比較して低いウイルス力価と関連していました。上澄み（> 48hpi）（P <0.05）。SYNGR2のこの重要なドメインにおける非保存的置換の同定は、SYNGR2p.Arg63Cys変異体がウイルス量に対する観察された遺伝的影響の根底にある可能性があることを示唆しています。"]
[57,30352075,"animal","pig","CRISPR;Cas9","TP53","PloS one","Generation of a TP53-modified porcine cancer model by CRISPR/Cas9-mediated gene modification in porcine zygotes via electroporation.",2018,"13(10):e0206360","[Tanihara F  et al.]","Tokushima University, Tokushima, Japan.",30352075,"10.1371/journal.pone.0206360 ","TP53 (which encodes p53) is one of the most frequently mutated genes in cancers.  In this study, we generated TP53-mutant pigs by gene editing via electroporation  of the Cas9 protein (GEEP), a process that involves introducing the Cas9 protein  and single-guide RNA (sgRNA) targeting exon 3 and intron 4 of TP53 into in vitro-fertilized zygotes. Zygotes modified by the sgRNAs were transferred to recipients, two of which gave birth to a total of 11 piglets. Of those 11 piglets, 9 survived. Molecular genetic analysis confirmed that 6 of 9 live piglets carried mutations in TP53, including 2 piglets with no wild-type (WT) sequences and 4 genetically mosaic piglets with WT sequences. One mosaic piglet had 142 and 151 bp deletions caused by a combination of the two sgRNAs. These piglets were continually monitored for 16 months and three of the genome-edited pigs (50%) exhibited various tumor phenotypes that we presumed were caused by TP53 mutations. Two mutant pigs with no WT sequences developed mandibular osteosarcoma and nephroblastoma. The mosaic pig with a deletion between targeting sites of two sgRNAs exhibited malignant fibrous histiocytoma. Tumor phenotypes of TP53 mosaic mutant pigs have not been previously reported. Our results indicated  that the mutations caused by gene editing successfully induced tumor phenotypes in both TP53 mosaic- and bi-allelic mutant pigs.","pig","TP53（p53をコードする）は、癌で最も頻繁に変異する遺伝子の1つです。この研究では、Cas9タンパク質とTP53のエクソン3とイントロン4を標的とするシングルガイドRNA（sgRNA）をinvitroに導入するプロセスであるCas9タンパク質（GEEP）のエレクトロポレーションを介した遺伝子編集によってTP53変異ブタを生成しました-受精したザイゴット。sgRNAによって改変された受精卵はレシピエントに移され、そのうちの2つは合計11匹の子豚を出産しました。それらの11匹の子豚のうち、9匹が生き残った。分子遺伝学的分析により、野生型（WT）配列を持たない2つの子豚と、WT配列を持つ4つの遺伝的モザイク子豚を含む、9つの生きた子豚のうち6つがTP53に変異を持っていることが確認されました。1つのモザイク子豚は2つのsgRNAの組み合わせによって引き起こされた142および151bpの欠失を持っていました。これらの子豚は16か月間継続的に監視され、ゲノム編集された豚のうち3頭（50％）は、TP53変異が原因であると推定されるさまざまな腫瘍表現型を示しました。WT配列を持たない2頭の変異ブタは、下顎骨肉腫と腎芽腫を発症しました。2つのsgRNAの標的部位間の欠失を伴うモザイクブタは、悪性線維性組織球腫を示した。TP53モザイク変異ブタの腫瘍表現型はこれまで報告されていません。我々の結果は、遺伝子編集によって引き起こされた突然変異が、TP53モザイクおよびバイアレル突然変異ブタの両方で腫瘍表現型を首尾よく誘発したことを示した。"]
[58,30543715,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","Rosa26","PLoS pathogens","Genetically modified pigs are protected from classical swine fever virus.",2018,"14(12):e1007193","[Xie Z et al.]","Jilin University, Changchun, Jilin, China.",30543715,"10.1371/journal.ppat.1007193 ","Classical swine fever (CSF) caused by classical swine fever virus (CSFV) is one of the most detrimental diseases, and leads to significant economic losses in the swine industry. Despite efforts by many government authorities to stamp out the disease from national pig populations, the disease remains widespread. Here, antiviral small hairpin RNAs (shRNAs) were selected and then inserted at the porcine Rosa26 (pRosa26) locus via a CRISPR/Cas9-mediated knock-in strategy. Finally, anti-CSFV transgenic (TG) pigs were produced by somatic nuclear transfer (SCNT). Notably, in vitro and in vivo viral challenge assays further demonstrated that these TG pigs could effectively limit the replication of CSFV and reduce CSFV-associated clinical signs and mortality, and disease resistance could be stably transmitted to the F1-generation. Altogether, our work demonstrated that RNA interference (RNAi) technology combining CRISPR/Cas9 technology offered the possibility to produce TG animal with improved resistance to viral infection. The use of these TG pigs can reduce CSF-related economic losses and this antiviral strategy may be useful for future antiviral research.","pig","豚コレラウイルス（CSFV）によって引き起こされる豚コレラ（CSF）は、最も有害な病気の1つであり、豚コレラ産業に重大な経済的損失をもたらします。国の豚集団からこの病気を撲滅するための多くの政府当局による努力にもかかわらず、この病気は依然として蔓延している。ここでは、抗ウイルス性の小さなヘアピンRNA（shRNA）が選択され、CRISPR / Cas9を介したノックイン戦略を介してブタのRosa26（pRosa26）遺伝子座に挿入されました。最後に、抗CSFVトランスジェニック（TG）ブタは、体細胞核移植（SCNT）によって生産されました。特に、invitroおよびinvivoウイルスチャレンジアッセイは、これらのTGブタがCSFVの複製を効果的に制限し、CSFV関連の臨床徴候および死亡率を低下させ、耐病性をF1世代に安定して伝達できることをさらに示しました。全体として、私たちの研究は、CRISPR / Cas9テクノロジーを組み合わせたRNA干渉（RNAi）テクノロジーが、ウイルス感染に対する耐性が向上したTG動物を生産する可能性を提供することを実証しました。これらのTG豚の使用は、CSF関連の経済的損失を減らすことができ、この抗ウイルス戦略は将来の抗ウイルス研究に役立つ可能性があります。"]
[59,29279391,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","IL1B2","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Inactivation of porcine interleukin-1beta results in failure of rapid conceptus elongation.",2018,"115(2):307-312","[Whyte JJ et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",29279391,"10.1073/pnas.1718004115 ","Conceptus expansion throughout the uterus of mammalian species with a noninvasive epitheliochorial type of placentation is critical establishing an adequate uterine surface area for nutrient support during gestation. Pig conceptuses undergo a unique rapid morphological transformation to elongate into filamentous  threads within 1 h, which provides the uterine surface to support development and maintain functional corpora lutea through the production of estrogen. Conceptus production of a unique interleukin 1beta, IL1B2, temporally increases during the  period of trophoblast remodeling during elongation. CRISPR/Cas9 gene editing was  used to knock out pig conceptus IL1B2 expression and the secretion of IL1B2 during the time of conceptus elongation. Trophoblast elongation occurred on day 14 in wild-type (IL1B2(+/+)) conceptuses but did not occur in ILB2-null (IL1B2(-/-)) conceptuses. Although the morphological transition of IL1B2(-/-) conceptuses was inhibited, expression of a number of conceptus developmental genes was not altered. However, conceptus aromatase expression and estrogen secretion were decreased, indicating that IL1B2 may be involved in the spatiotemporal increase in conceptus estrogen synthesis needed for the establishment of pregnancy in the pig and may serve to regulate the proinflammatory response of endometrium to IL1B2 during conceptus elongation and  attachment to the uterine surface.","pig","非侵襲性上皮絨毛型胎盤を伴う哺乳動物種の子宮全体にわたる受胎産物の拡大は、妊娠中の栄養素のサポートのための適切な子宮表面積を確立するために重要です。豚の受胎産物は、独特の急速な形態変化を経て、1時間以内に糸状の糸に伸長します。これにより、子宮表面が発達をサポートし、エストロゲンの産生を通じて機能的なルテア体を維持します。ユニークなインターロイキン1β、IL1B2の受胎産物の産生は、伸長中の栄養膜リモデリングの期間中に一時的に増加します。CRISPR / Cas9遺伝子編集を使用して、ブタ受胎産物のIL1B2発現と受胎産物伸長時のIL1B2の分泌をノックアウトしました。栄養膜の伸長は、野生型（IL1B2（+ / +））の受胎産物では14日目に発生しましたが、ILB2-null（IL1B2（-/-））の受胎産物では発生しませんでした。IL1B2（-/-）受胎産物の形態学的移行は阻害されたが、多くの受胎産物発生遺伝子の発現は変化しなかった。ただし、受胎産物アロマターゼの発現とエストロゲン分泌が減少し、IL1B2がブタの妊娠の確立に必要な受胎産物エストロゲン合成の時空間的増加に関与し、受胎産物の伸長中のIL1B2に対する子宮内膜の炎症誘発性応答を調節するのに役立つ可能性があることを示しています。子宮表面への付着。"]
[60,29135047,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","FGF10","Reproduction in domestic animals = Zuchthygiene","Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.",2018,"53(2):313-318","[Nishio K et al.]","Tokushima University, Tokushima, Japan.",29135047,"10.1111/rda.13106 ","This study was conducted to determine suitable conditions for an experimental method in which the CRISPR/Cas9 system is introduced into in vitro-produced porcine zygotes by electroporation. In the first experiment, when putative zygotes derived from in vitro fertilization (IVF) were electroporated by either unipolar or bipolar pulses, keeping the voltage, pulse duration and pulse number  fixed at 30 V/mm, 1 msec and five repeats, respectively, the rate of blastocyst formation from zygotes electroporated by bipolar pulses decreased compared to zygotes electroporated by unipolar pulses. In the second experiment, the putative zygotes were electroporated by electroporation voltages ranging from 20 V/mm-40 V/mm with five 1-msec unipolar pulses. The rate of cleavage and blastocyst formation of zygotes electroporated at 40 V/mm was significantly lower (p < .05)  than that of zygotes electroporated at less than 30 V/mm. Moreover, the apoptotic nuclei indices of blastocysts derived from zygotes electroporated by voltages greater than 30 V/mm significantly increased compared with those from zygotes electroporated by voltages less than 25 V/mm (p < .05). When zygotes were electroporated with Cas9 mRNA and single-guide RNA (sgRNA) targeting site in the  FGF10 exon 3, the proportions of blastocysts with targeted genomic sequences were 7.7% (2/26) and 3.6% (1/28) in the embryos derived from zygotes electroporated at 25 V/mm and 30 V/mm, respectively. Our results indicate that electroporation at 25 V/mm may be an acceptable condition for introducing Cas9 mRNA and sgRNA into pig IVF zygotes under which the viability of the embryos is not significantly affected.","pig","この研究は、CRISPR / Cas9システムをエレクトロポレーションによってinvitroで生産されたブタの接合子に導入する実験方法に適した条件を決定するために実施されました。最初の実験では、体外受精（IVF）に由来する推定接合子を単極または双極パルスでエレクトロポレーションし、電圧、パルス持続時間、パルス数をそれぞれ30 V / mm、1ミリ秒、5回の繰り返しに固定しました。双極パルスによってエレクトロポレーションされた接合子からの胚盤胞形成の速度は、単極パルスによってエレクトロポレーションされた接合子と比較して減少した。2番目の実験では、推定接合子は、5つの1ミリ秒の単極パルスで20 V / mm〜40 V / mmの範囲のエレクトロポレーション電圧によってエレクトロポレーションされました。40 V / mmでエレクトロポレーションした接合子の卵割と胚盤胞形成の速度は、30 V / mm未満でエレクトロポレーションした接合子のそれよりも有意に低かった（p <.05）。さらに、30 V / mmを超える電圧でエレクトロポレーションされた接合子に由来する胚盤胞のアポトーシス核指数は、25 V / mm未満の電圧でエレクトロポレーションされた接合子に由来するものと比較して有意に増加しました（p <.05）。FGF10エクソン3のCas9mRNAおよびシングルガイドRNA（sgRNA）標的部位で接合子をエレクトロポレーションした場合、標的ゲノム配列を持つ胚盤胞の割合は、胚で7.7％（2/26）および3.6％（1/28）でした。それぞれ25V / mmと30V / mmでエレクトロポレーションされた接合子に由来します。我々の結果は、25 V / mmでのエレクトロポレーションが、Cas9 mRNAおよびsgRNAをブタのIVF接合子に導入するための許容可能な条件であり、その下では胚の生存率に大きな影響がないことを示しています。"]
[61,29743638,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","Pifs501","Scientific reports","Screen and Verification for Transgene Integration Sites in Pigs.",2018,"8(1):7433","[Ma L et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",29743638,"10.1038/s41598-018-24481-1 ","Efficient transgene expression in recipient cells constitutes the primary step in gene therapy. However, random integration in host genome comprises too many uncertainties. Our study presents a strategy combining bioinformatics and functional verification to find transgene integration sites in pig genome. Using  an in silico approach, we screen out two candidate sites, namely, Pifs302 and Pifs501, located in actively transcribed intergenic regions with low nucleosome formation potential and without potential non-coding RNAs. After CRISPR/Cas9-mediated site-specific integration on Pifs501, we detected high EGFP  expression in different pig cell types and ubiquitous EGFP expression in diverse  tissues of transgenic pigs without adversely affecting 600 kb neighboring gene expression. Promoters integrated on Pifs501 exhibit hypomethylated modification,  which suggest a permissive epigenetic status of this locus. We establish a versatile master cell line on Pifs501, which allows us to achieve site-specific exchange of EGFP to Follistatin with Cre/loxP system conveniently. Through in vitro and in vivo functional assays, we demonstrate the effectiveness of this screening method, and take Pifs501 as a potential site for transgene insertion in pigs. We anticipate that Pifs501 will have useful applications in pig genome engineering, though the identification of genomic safe harbor should over long-term various functional studies.","pig","レシピエント細胞における効率的な導入遺伝子発現は、遺伝子治療の主要なステップを構成します。ただし、ホストゲノムへのランダムな統合には、不確実性が多すぎます。私たちの研究は、バイオインフォマティクスと機能検証を組み合わせて、ブタゲノム内の導入遺伝子統合部位を見つける戦略を示しています。インシリコアプローチを使用して、ヌクレオソーム形成の可能性が低く、潜在的な非コードRNAのない活発に転写された遺伝子間領域に位置する2つの候補部位、すなわちPifs302とPifs501をスクリーニングします。Pifs501でのCRISPR / Cas9を介した部位特異的統合後、600 kbの隣接遺伝子発現に悪影響を与えることなく、さまざまなブタ細胞タイプで高いEGFP発現を、トランスジェニックブタの多様な組織で遍在するEGFP発現を検出しました。Pifs501に統合されたプロモーターは、低メチル化修飾を示します。これは、この遺伝子座の許容的なエピジェネティックな状態を示唆しています。Pifs501で多用途のマスター細胞株を確立し、Cre / loxPシステムを使用してEGFPからフォリスタチンへの部位特異的交換を簡単に実現できるようにします。invitroおよびinvivo機能アッセイを通じて、このスクリーニング法の有効性を実証し、Pifs501をブタへの導入遺伝子挿入の潜在的な部位として採用します。Pifs501は、ブタのゲノム工学において有用なアプリケーションになると予想されますが、ゲノムのセーフハーバーの特定は、長期にわたるさまざまな機能研究にまたがるはずです。"]
[62,29555974,"animal","pig","TALENs;","MYH7","Scientific reports","Successful knock-in of Hypertrophic Cardiomyopathy-mutation R723G into the MYH7 gene mimics HCM pathology in pigs.",2018,"8(1):4786","[Montag J  et al.]","Hannover Medical School, Hannover, Germany.",29555974,"10.1038/s41598-018-22936-z ","Familial Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) is the most common inherited cardiac disease. About 30% of the patients are heterozygous for mutations in the MYH7 gene encoding the ss-myosin heavy chain (MyHC). Hallmarks of HCM are cardiomyocyte disarray and hypertrophy of the left ventricle, the symptoms range  from slight arrhythmias to sudden cardiac death or heart failure. To gain insight into the underlying mechanisms of the diseases' etiology we aimed to generate genome edited pigs with an HCM-mutation. We used TALEN-mediated genome editing and successfully introduced the HCM-point mutation R723G into the MYH7 gene of porcine fibroblasts and subsequently cloned pigs that were heterozygous for the HCM-mutation R723G. No off-target effects were determined in the R723G-pigs. Surprisingly, the animals died within 24 h post partem, probably due to heart failure as indicated by a shift in the a/ss-MyHC ratio in the left ventricle. Most interestingly, the neonatal pigs displayed features of HCM, including mild myocyte disarray, malformed nuclei, and MYH7-overexpression. The finding of HCM-specific pathology in neonatal R723G-piglets suggests a very early onset of the disease and highlights the importance of novel large animal models for studying causative mechanisms and long-term progression of human cardiac diseases.","pig","家族性肥大型心筋症（HCM）は、最も一般的な遺伝性心疾患です。患者の約30％は、ss-ミオシン重鎖（MyHC）をコードするMYH7遺伝子の変異についてヘテロ接合です。HCMの特徴は、心筋細胞の乱れと左心室の肥大であり、症状は軽度の不整脈から心臓突然死または心不全にまで及びます。病気の病因の根底にあるメカニズムへの洞察を得るために、HCM変異を持つゲノム編集されたブタを生成することを目指しました。TALENを介したゲノム編集を使用し、HCM点突然変異R723Gをブタの線維芽細胞のMYH7遺伝子に導入し、その後、HCM突然変異R723Gのヘテロ接合体であるブタをクローン化しました。R723G豚では、オフターゲット効果は確認されませんでした。驚いたことに、左心室のa / ss-MyHC比の変化によって示されるように、おそらく心不全が原因で、動物は産後24時間以内に死亡しました。最も興味深いことに、新生児ブタは、軽度の筋細胞の乱れ、奇形の核、MYH7の過剰発現などのHCMの特徴を示しました。新生児のR723G子豚におけるHCM特異的病理の発見は、疾患の非常に早期の発症を示唆し、原因となるメカニズムとヒトの心臓病の長期進行を研究するための新しい大型動物モデルの重要性を強調しています。"]
[63,29483633,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","neurogenin 3","Scientific reports","Targeted Mutation of NGN3 Gene Disrupts Pancreatic Endocrine Cell Development in  Pigs.",2018,"8(1):3582","[Sheets TP et al.]","University of Maryland, College Park, MD, USA.",29483633,"10.1038/s41598-018-22050-0 ","The domestic pig is an attractive model for biomedical research because of similarities in anatomy and physiology to humans. However, key gaps remain in our understanding of the role of developmental genes in pig, limiting its full potential. In this publication, the role of NEUROGENIN 3 (NGN3), a transcription  factor involved in endocrine pancreas development has been investigated by CRISPR/Cas9 gene ablation. Precomplexed Cas9 ribonucleoproteins targeting NGN3 were injected into in vivo derived porcine embryos, and transferred into surrogate females. On day 60 of pregnancy, nine fetuses were collected for genotypic and phenotypic analysis. One of the piglets was identified as an in-frame biallelic knockout (Delta2/Delta2), which showed a loss of putative NGN3-downstream target genes: NEUROD1 and PAX4, as well as insulin, glucagon, somatostatin and pancreatic polypeptide-Y. Fibroblasts from this fetus were used  in somatic cell nuclear transfer to generate clonal animals to qualify the effect of mutation on embryonic lethality. Three live piglets were born, received colostrum and suckled normally, but experienced extreme weight loss over a 24 to  36-hour period requiring humane euthanasia. Expression of pancreatic endocrine hormones: insulin, glucagon, and somatostatin were lost. The data support a critical role of NGN3 in porcine endocrine pancreas development.","pig","家畜のブタは、解剖学と生理学が人間と類似しているため、生物医学研究にとって魅力的なモデルです。ただし、豚の発生遺伝子の役割についての理解には重要なギャップが残っており、その可能性を最大限に制限しています。この出版物では、内分泌膵臓の発達に関与する転写因子であるニューロゲニン3（NGN3）の役割が、CRISPR / Cas9遺伝子アブレーションによって調査されています。NGN3を標的とする事前に複合化されたCas9リボ核タンパク質は、in vivo由来のブタ胚に注入され、代理母に移されました。妊娠60日目に、遺伝子型および表現型の分析のために9人の胎児を収集しました。子豚の1つは、インフレームの2対立遺伝子ノックアウト（Delta2 / Delta2）として識別され、推定NGN3下流標的遺伝子：NEUROD1およびPAX4、ならびにインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチド-Yの喪失を示しました。この胎児からの線維芽細胞は、体細胞核移植で使用され、胚の致死性に対する突然変異の影響を認定するためのクローン動物を生成しました。3頭の生きた子豚が生まれ、初乳を与えられ、正常に授乳されましたが、24〜36時間の間に極端な体重減少が見られ、人道的な安楽死が必要でした。膵臓内分泌ホルモンの発現：インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンが失われました。データは、ブタの内分泌膵臓の発達におけるNGN3の重要な役割を裏付けています。"]
[64,29195121,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","alpha-1,3-galactosyltransferase","Theriogenology","Timing of CRISPR/Cas9-related mRNA microinjection after activation as an important factor affecting genome editing efficiency in porcine oocytes.",2018,"108:29-38","[Sato M et al.]","Kagoshima University, Kagoshima, Japan.",29195121,"10.1016/j.theriogenology.2017.11.030 ","Recently, successful one-step genome editing by microinjection of CRISPR/Cas9-related mRNA components into the porcine zygote has been described. Given the relatively long gestational period and the high cost of housing swine,  the establishment of an effective microinjection-based porcine genome editing method is urgently required. Previously, we have attempted to disrupt a gene encoding alpha-1,3-galactosyltransferase (GGTA1), which synthesizes the alpha-Gal epitope, by microinjecting CRISPR/Cas9-related nucleic acids and enhanced green fluorescent protein (EGFP) mRNA into porcine oocytes immediately after electrical activation. We found that genome editing was indeed induced, although the resulting blastocysts were mosaic and the frequency of modified cells appeared to be low (50%). To improve genome editing efficiency in porcine oocytes, cytoplasmic injection was performed 6 h after electrical activation, a stage wherein the pronucleus is formed. The developing blastocysts exhibited higher levels of EGFP. Furthermore, the T7 endonuclease 1 assay and subsequent sequencing demonstrated that these embryos exhibited increased genome editing efficiencies (69%), although a high degree of mosaicism for the induced mutation  was still observed. Single blastocyst-based cytochemical staining with fluorescently labeled isolectin BS-I-B4 also confirmed this mosaicism. Thus, the  development of a technique that avoids or reduces such mosaicism would be a key factor for efficient knock out piglet production via microinjection.","pig","最近、CRISPR / Cas9関連のmRNA成分をブタの接合子にマイクロインジェクションすることによるワンステップゲノム編集の成功が報告されています。妊娠期間が比較的長く、豚の飼育費が高いことを考えると、効果的なマイクロインジェクションベースのブタゲノム編集法の確立が緊急に必要とされています。以前、我々は、CRISPR / Cas9関連核酸と強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）mRNAをブタ卵母細胞にマイクロインジェクションすることにより、α-Galエピトープを合成するα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ（GGTA1）をコードする遺伝子の破壊を試みました。電気的活性化の直後。得られた胚盤胞はモザイク状であり、改変された細胞の頻度は低いように見えたが（50％）、ゲノム編集が実際に誘導されたことがわかった。ブタ卵母細胞のゲノム編集効率を改善するために、電気的活性化の6時間後、前核が形成される段階で細胞質注入を行った。発生中の胚盤胞は、より高いレベルのEGFPを示した。さらに、T7エンドヌクレアーゼ1アッセイとその後のシーケンシングにより、これらの胚はゲノム編集効率の向上（69％）を示しましたが、誘発された突然変異の高度なモザイク現象は依然として観察されました。蛍光標識されたイソレクチンBS-I-B4による単一胚盤胞ベースの細胞化学的染色もこのモザイク現象を確認しました。したがって、そのようなモザイク現象を回避または低減する技術の開発は、マイクロインジェクションによる効率的なノックアウト子豚の生産のための重要な要素となるでしょう。"]
[65,29691708,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","INS","Transgenic research","Generation of insulin-deficient piglets by disrupting INS gene using CRISPR/Cas9  system.",2018,"27(3):289-300","[Cho B et al.]","Mgenplus Co., Ltd., Seoul, Korea.",29691708,"10.1007/s11248-018-0074-1 ","Diabetes mellitus is a chronic disease with accompanying severe complications. Various animal models, mostly rodents due to availability of genetically modified lines, have been used to investigate the pathophysiology of diabetes. Using pigs  for diabetic research can be beneficial because of their similarity in size, pathogenesis pathway, physiology, and metabolism with human. However, the use of  pigs for diabetes research has been hampered due to only few pig models presenting diabetes symptoms. In this study, we have successfully generated insulin-deficient pigs by generating the indels of the porcine INS gene in somatic cells using CRISPR/Cas9 system followed by somatic cell nuclear transfer. First, somatic cells carrying a modified INS gene were generated using CRISPR/Cas9 system and their genotypes were confirmed by T7E1 assay; targeting efficiency was 40.4% (21/52). After embryo transfer, three live and five stillborn piglets were born. As expected, INS knockout piglets presented high blood glucose levels and glucose was detected in the urine. The level of insulin  and c-peptide in the blood serum of INS knockout piglets were constant after feeding and the expression of insulin in the pancreas was absent in those piglets. This study demonstrates effectiveness of CRISPR/Cas9 system in generating novel pig models. We expect that these insulin-deficient pigs can be used in diabetes research to test the efficacy and safety of new drugs and the recipient of islet transplantation to investigate optimal transplantation strategies.","pig","糖尿病は、重篤な合併症を伴う慢性疾患です。糖尿病の病態生理学を調査するために、さまざまな動物モデル、主に遺伝子組み換え系統が利用できるためにげっ歯類が使用されてきました。ブタを糖尿病研究に使用することは、サイズ、病因経路、生理学、およびヒトとの代謝が類似しているため、有益な場合があります。しかし、糖尿病の症状を示すブタのモデルが少ないため、糖尿病の研究にブタを使用することは妨げられてきました。この研究では、CRISPR / Cas9システムを使用して体細胞にブタINS遺伝子のインデルを生成し、続いて体細胞核移植を行うことにより、インスリン欠乏ブタの生成に成功しました。まず、CRISPR / Cas9システムを使用して、改変されたINS遺伝子を持つ体細胞を生成し、それらの遺伝子型をT7E1アッセイで確認しました。ターゲティング効率は40.4％（21/52）でした。胚移植後、3匹の生きた子豚と5匹の死産の子豚が生まれました。予想通り、INSノックアウト子豚は高い血糖値を示し、尿中にブドウ糖が検出されました。INSノックアウト子豚の血清中のインスリンとc-ペプチドのレベルは、摂食後も一定であり、膵臓でのインスリンの発現はそれらの子豚では見られませんでした。この研究は、新規ブタモデルの生成におけるCRISPR / Cas9システムの有効性を示しています。これらのインスリン欠乏豚は、糖尿病研究で新薬の有効性と安全性をテストし、膵島移植のレシピエントを使用して最適な移植戦略を調査できると期待しています。"]
[66,30352599,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)","Virology journal","RIG-I is responsible for activation of type I interferon pathway in Seneca Valley virus-infected porcine cells to suppress viral replication.",2018,"15(1):162","[Li P et al.]","Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, China.",30352599,"10.1186/s12985-018-1080-x ","BACKGROUND: Retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) is a key cytosolic receptor of the innate immune system. Seneca valley virus (SVV) is a newly emerging RNA virus that infects pigs causing significant economic losses in pig industry. RIG-I plays different roles during different viruses infections. The role of RIG-I in SVV-infected cells remains unknown. Understanding of the role of RIG-I during SVV infection will help to clarify the infection process of SVV in the infected cells. METHODS: In this study, we generated a RIG-I knockout (KO) porcine kidney  PK-15 cell line using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein-9 nuclease (Cas9) genome editing tool. The RIG-I gene sequence of RIG-I KO cells were determined by Sanger sequencing method, and the expression of RIG-I protein in the RIG-I KO cells were detected by Western bloting. The activation status of type I interferon pathway in Sendai  virus (SeV)- or SVV-infected RIG-I KO cells was investigated by measuring the mRNA expression levels of interferon (IFN)-beta and IFN-stimulated genes (ISGs).  The replicative state of SVV in the RIG-I KO cells was evaluated by qPCR, Western bloting, TCID50 assay and indirect immunofluorescence assay. RESULTS: Gene editing of RIG-I in PK-15 cells successfully resulted in the destruction of RIG-I expression. RIG-I KO PK-15 cells had a lower expression of IFN-beta and ISGs compared with wildtype (WT) PK-15 cells when stimulated by the model RNA virus SeV. The amounts of viral RNA and viral protein as well as viral yields in SVV-infected RIG-I WT and KO cells were determined and compared, which showed that knockout of RIG-I significantly increased SVV replication and propagation. Meanwhile, the expression of IFN-beta and ISGs were considerably decreased in RIG-I KO cells compared with that in RIG-I WT cells during SVV infection. CONCLUSION: Altogether, this study indicated that RIG-I showed an antiviral role  against SVV and was essential for activation of type I IFN signaling during SVV infection. In addition, this study suggested that the CRISPR/Cas9 system can be used as an effective tool to modify cell lines to increase viral yields during SVV vaccine development.","pig","背景：レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）は、自然免疫系の重要な細胞質ゾル受容体です。セネカバレーウイルス（SVV）は、豚に感染して養豚業界に重大な経済的損失をもたらす新たに出現したRNAウイルスです。RIG-Iは、さまざまなウイルス感染時にさまざまな役割を果たします。SVV感染細胞におけるRIG-Iの役割は不明なままです。SVV感染時のRIG-Iの役割を理解することは、感染細胞におけるSVVの感染プロセスを明らかにするのに役立ちます。方法：この研究では、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質-9ヌクレアーゼ（Cas9）ゲノム編集ツールを使用してRIG-Iノックアウト（KO）ブタ腎臓PK-15細胞株を生成しました。RIG-I KO細胞のRIG-I遺伝子配列はサンガーシーケンシング法によって決定され、RIG-IKO細胞におけるRIG-Iタンパク質の発現はウエスタンブロット法によって検出されました。センダイウイルス（SeV）またはSVVに感染したRIG-I KO細胞におけるI型インターフェロン経路の活性化状態を、インターフェロン（IFN）-ベータおよびIFN刺激遺伝子（ISG）のmRNA発現レベルを測定することによって調査しました。RIG-I KO細胞におけるSVVの複製状態は、qPCR、ウエスタンブロッティング、TCID50アッセイ、および間接免疫蛍光アッセイによって評価されました。結果：PK-15細胞におけるRIG-Iの遺伝子編集は、RIG-I発現の破壊に成功しました。RIG-I KO PK-15細胞は、モデルRNAウイルスSeVによって刺激された場合、野生型（WT）PK-15細胞と比較してIFN-βおよびISGの発現が低かった。SVVに感染したRIG-IWTおよびKO細胞におけるウイルスRNAおよびウイルスタンパク質の量、ならびにウイルス収量を測定および比較したところ、RIG-IのノックアウトによりSVVの複製および増殖が有意に増加したことが示された。一方、IFN-betaおよびISGの発現は、SVV感染時にRIG-IWT細胞と比較してRIG-IKO細胞でかなり減少しました。結論：全体として、この研究は、RIG-IがSVVに対して抗ウイルスの役割を示し、SVV感染中のI型IFNシグナル伝達の活性化に不可欠であることを示しました。さらに、この研究は、CRISPR / Cas9システムが、SVVワクチン開発中のウイルス収量を増加させるために細胞株を改変するための効果的なツールとして使用できることを示唆しました。"]
[67,30021719,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","miR-302/367","Yi chuan = Hereditas","[Assessing abundance and specificity of different types of sgRNA targeting miRNA  precursors].",2018,"40(7):561-571","[Liu HL et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",30021719,"10.16288/j.yczz.17-417 ","CRISPR/Cas technology enables efficient and specific editing the genome. Since different bacterial sources or artificially modified Cas9, as well as Cpf1 and other nucleases, recognize different PAMs (protospacer adjacent motifs), different gene editing nucleases may use different types of sgRNAs (small guide RNA). MicroRNAs (miRNAs) are a class of regulatory small non-coding RNAs. To determine whether specific targets for sgRNAs in miRNA precursor exit, the abundance and specificity of 11 different types of sgRNA targeting 28 645 miRNA precursors were analyzed in the present study using the CRISPR-offinder, a bioinformatics software developed in our own laboratory. The CRISPR/Cas9 lentivirus technology was used to target the miR-302/367 cluster in a porcine cell line, and its knockout efficiency for the miRNA target was evaluated. The results show that there are about 8 different types of sgRNAs that can target individual miRNA precursors. By assessing the off-target effect, only 18.2% of the sgRNAs showed high specificity for targeting the porcine miRNA precursors. Lastly, using the miR-302/367 cluster target as an example, we showed that the CRISPR/Cas9 lentivirus technology was 40% efficient in successfully establishing  correct knockout of the target miRNA in the porcine cell line. This present study provides an important resource for the use of CRISPR/Cas technology to target miRNAs for knockout studies.","pig","CRISPR / Casテクノロジーは、ゲノムの効率的かつ特異的な編集を可能にします。異なる細菌源または人工的に修飾されたCas9、ならびにCpf1および他のヌクレアーゼは、異なるPAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）を認識するため、異なる遺伝子編集ヌクレアーゼは、異なるタイプのsgRNA（小さなガイドRNA）を使用する場合があります。マイクロRNA（miRNA）は、規制の小さな非コードRNAのクラスです。miRNA前駆体のsgRNAの特定のターゲットが存在するかどうかを判断するために、本研究では、自社の研究室で開発されたバイオインフォマティクスソフトウェアであるCRISPR-offinderを使用して、28,645のmiRNA前駆体をターゲットとする11種類のsgRNAの存在量と特異性を分析しました。CRISPR / Cas9レンチウイルステクノロジーを使用して、ブタ細胞株のmiR-302 / 367クラスターを標的とし、miRNA標的に対するノックアウト効率を評価しました。結果は、個々のmiRNA前駆体を標的とすることができる約8種類のsgRNAがあることを示しています。オフターゲット効果を評価することにより、sgRNAの18.2％のみがブタmiRNA前駆体を標的とする高い特異性を示しました。最後に、miR-302 / 367クラスターターゲットを例として使用して、CRISPR / Cas9レンチウイルステクノロジーがブタ細胞株でターゲットmiRNAの正しいノックアウトを確立するのに40％効率的であることを示しました。この現在の研究は、ノックアウト研究のためにmiRNAを標的とするCRISPR / Casテクノロジーの使用のための重要なリソースを提供します。"]
[68,29801435,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;"," ","BMC genomics","Low incidence of SNVs and indels in trio genomes of Cas9-mediated multiplex edited sheep.",2018,"19(1):397","[Wang X  et al.]","College of Animal Science and Technology, Yangling, China.",29801435,"10.1186/s12864-018-4712-z ","BACKGROUND: The simplicity of the CRISPR/Cas9 system has enabled its widespread applications in generating animal models, functional genomic screening and in treating genetic and infectious diseases. However, unintended mutations produced  by off-target CRISPR/Cas9 nuclease activity may lead to negative consequences. Especially, a very recent study found that gene editing can introduce hundreds of unintended mutations into the genome, and have attracted wide attention. RESULTS: To address the off-target concerns, urgent characterization of the CRISPR/Cas9-mediated off-target mutagenesis is highly anticipated. Here we took advantage of our previously generated gene-edited sheep and performed family trio-based whole genome sequencing which is capable of discriminating variants in the edited progenies that are inherited, naturally generated, or induced by genetic modification. Three family trios were re-sequenced at a high average depth of genomic coverage (~ 25.8x). After developing a pipeline to comprehensively analyze the sequence data for de novo single nucleotide variants, indels and structural variations from the genome; we only found a single unintended event in the form of a 2.4 kb inversion induced by site-specific double-strand breaks between two sgRNA targeting sites at the MSTN locus with a low incidence. CONCLUSIONS: We provide the first report on the fidelity of CRISPR-based modification for sheep genomes targeted simultaneously for gene breaks at three coding sequence locations. The trio-based sequencing approach revealed almost negligible off-target modifications, providing timely evidences of the safe application of genome editing in vivo with CRISPR/Cas9.","sheep","背景：CRISPR / Cas9システムのシンプルさは、動物モデルの生成、機能ゲノムスクリーニング、および遺伝性疾患や感染症の治療における広範なアプリケーションを可能にしました。ただし、オフターゲットCRISPR / Cas9ヌクレアーゼ活性によって生成された意図しない変異は、否定的な結果につながる可能性があります。特に、ごく最近の研究では、遺伝子編集が何百もの意図しない突然変異をゲノムに導入する可能性があることがわかり、幅広い注目を集めています。結果：オフターゲットの懸念に対処するために、CRISPR / Cas9を介したオフターゲット変異誘発の緊急の特性評価が大いに期待されています。ここでは、以前に生成された遺伝子編集された羊を利用し、遺伝的、自然に生成された、または遺伝子改変によって誘導された編集された子孫の変異を識別することができるファミリートリオベースの全ゲノムシーケンスを実行しました。3つのファミリートリオは、ゲノムカバレッジの高い平均深度（〜25.8x）で再シーケンスされました。パイプラインを開発して、ゲノムからのde novo一塩基多型、インデル、および構造変化の配列データを包括的に分析した後。発生率の低いMSTN遺伝子座の2つのsgRNAターゲティング部位間の部位特異的二本鎖切断によって誘発される2.4kb反転の形で単一の意図しないイベントのみが見つかりました。結論：3つのコード配列位置での遺伝子切断を同時に標的とするヒツジゲノムに対するCRISPRベースの修飾の忠実度に関する最初のレポートを提供します。トリオベースのシーケンシングアプローチは、ほとんど無視できるオフターゲットの変更を明らかにし、CRISPR / Cas9を使用したinvivoでのゲノム編集の安全なアプリケーションのタイムリーな証拠を提供します。"]
[69,30282831,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","Cystic fibrosis  transmembrane conductance regulator (CFTR)","JCI insight","A sheep model of cystic fibrosis generated by CRISPR/Cas9 disruption of the CFTR  gene.",2018,"3(19)","[Fan Z et al.]","Utah State University, Logan, UT, USA.",30282831,"10.1172/jci.insight.123529 ","Cystic fibrosis (CF) is a genetic disease caused by mutations in the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. The major cause of limited life  span in CF patients is progressive lung disease. CF models have been generated in 4 species (mice, rats, ferrets, and pigs) to enhance our understanding of the CF  pathogenesis. Sheep may be a particularly relevant animal to model CF in humans due to the similarities in lung anatomy and development in the two species. Here, we describe the generation of a sheep model for CF using CRISPR/Cas9 genome editing and somatic cell nuclear transfer (SCNT) techniques. We generated cells with CFTR gene disruption and used them for production of CFTR-/- and CFTR+/- lambs. The newborn CFTR-/- sheep developed severe disease consistent with CF pathology in humans. Of particular relevance were pancreatic fibrosis, intestinal obstruction, and absence of the vas deferens. Also, substantial liver and gallbladder disease may reflect CF liver disease that is evident in humans. The phenotype of CFTR-/- sheep suggests this large animal model will be a useful resource to advance the development of new CF therapeutics. Moreover, the generation of specific human CF disease-associated mutations in sheep may advance personalized medicine for this common genetic disorder.","sheep","嚢胞性線維症（CF）は、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター（CFTR）遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝性疾患です。CF患者の寿命が限られている主な原因は進行性肺疾患です。CFモデルは、CFの病因の理解を深めるために、4種（マウス、ラット、フェレット、ブタ）で生成されています。ヒツジは、2種の肺の解剖学的構造と発達が類似しているため、ヒトのCFをモデル化するのに特に関連する動物である可能性があります。ここでは、CRISPR / Cas9ゲノム編集と体細胞核移植（SCNT）技術を使用したCFの羊モデルの生成について説明します。CFTR遺伝子破壊を伴う細胞を生成し、CFTR-/-およびCFTR +/-子羊の生産に使用しました。新生児CFTR-/-羊は、ヒトのCF病理と一致する重篤な疾患を発症しました。特に関連性があったのは、膵臓線維症、腸閉塞、および精管の欠如でした。また、実質的な肝臓および胆嚢疾患は、ヒトで明らかなCF肝疾患を反映している可能性があります。CFTR-/-羊の表現型は、この大型動物モデルが新しいCF治療薬の開発を進めるための有用なリソースになることを示唆しています。さらに、ヒツジにおける特定のヒトCF疾患関連変異の生成は、この一般的な遺伝性疾患の個別化医療を進歩させる可能性があります。"]
[70,30485515,"animal","sheep","CRISPR;","acetyl-coenzyme A acyltranferase 2","Journal of cellular biochemistry","Acetyl-coenzyme A acyltransferase 2 promote the differentiation of sheep precursor adipocytes into adipocytes.",2018,null,"[Zhang Y et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu, China.",30485515,"10.1002/jcb.28080 ","The acetyl CoA acyltransferase 2 (ACAA2) is a key enzyme of the fatty acid oxidation pathway, catalyzing the last step of the mitochondrial beta oxidation,  thus playing an important role in the fatty acid metabolism. The purpose of this  study was to investigate the effect of knocking out ACAA2 on the expression of genes lipoprteinlipase (LPL), peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-gamma), fatty acid synthase, fat mass and obesity-associated gene, adipocyte fatty acid-binding protein (AP2) in precursor adipocytes and their differentiation into adipocytes. The knockout vector was constructed using CRISPR-Cas RNA-guided nuclease technology with an efficiency of 23.80%, and the vector was transfected into precursor adipocyte cells, while an overexpression vector of the ACAA2 gene was also transfected in another group of preadipocytes.  Quantitative polymerase chain reaction showed that the expression of the PPAR-gamma, LPL, and AP2 was significantly lower in the knockout compared with the overexpression group, while there was no difference in cell growth. After induction of adipocyte precursor cells into adipocytes using dexamethasone, insulin, and IBMX, oil red staining showed a significantly different number of lipid droplets in the knockout group. These results provide a preliminary indication for a possible involvement of the ACAA2 gene in adipocyte differentiation in vitro.","sheep","アセチルCoAアシルトランスフェラーゼ2（ACAA2）は、脂肪酸酸化経路の重要な酵素であり、ミトコンドリアのベータ酸化の最終段階を触媒するため、脂肪酸代謝において重要な役割を果たします。この研究の目的は、遺伝子リポプルテインリパーゼ（LPL）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（PPARガンマ）、脂肪酸シンターゼ、脂肪量および肥満関連遺伝子、脂肪細胞の発現に対するACAA2のノックアウトの影響を調査することでした。前駆脂肪細胞における脂肪酸結合タンパク質（AP2）およびそれらの脂肪細胞への分化。ノックアウトベクターは、CRISPR-Cas RNAガイドヌクレアーゼテクノロジーを使用して23.80％の効率で構築され、ベクターは前駆体脂肪細胞にトランスフェクトされ、ACAA2遺伝子の過剰発現ベクターも前脂肪細胞の別のグループにトランスフェクトされました。定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、PPAR-γ、LPL、およびAP2の発現が、過剰発現群と比較してノックアウトで有意に低かったが、細胞増殖に差がなかったことを示した。デキサメタゾン、インスリン、およびIBMXを使用して脂肪細胞前駆細胞を脂肪細胞に誘導した後、オイルレッド染色は、ノックアウトグループで有意に異なる数の脂肪滴を示しました。これらの結果は、invitroでの脂肪細胞分化におけるACAA2遺伝子の関与の可能性についての予備的な指標を提供します。"]
[71,30242885,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","myostatin","Journal of cellular biochemistry","CRISPR/Cas9-mediated sheep MSTN gene knockout and promote sSMSCs differentiation.",2018,null,"[Zhang Y et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, China.",30242885,"10.1002/jcb.27474 ","Myostatin (MSTN) is an important gene involved in the regulation of embryonic muscle cells and adult muscle development; it has a good application prospect in  transgenic animal production by improving the yield of muscle. The purpose of this study is to construct MSTN gene knockout vector using clustered regularly interspaced short palindromic repeats ( CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 ( Cas9). The knockout efficiency was evaluated in sheep ear fibroblasts (SEFs) by cleavage activity of transcription of guide RNA ( gRNA), luciferase-single-strand annealing assay, T7 endonuclease I assay (T7E1), and TA clone sequence (10/38); and above all, detection showed that the cleavage activity of CRISPR/Cas9-mediated MSTN reached 29%. MSTN-Cas9/gRNA4 was transfected into sheep skeletal muscle satellite cell (sSMSC) to confirm the function of MSTN in myotomes formation induced by starvation in low-serum medium. The results showed  that myotubes formation efficiency were 11.2 +/- 1.3% and 19.5 +/- 2.1% in the control group and knockout group, respectively. The average length of myotomes was 22 +/- 5.3 and 47 +/- 3.6 mum, displaying that MSTN knockout can promote sSMSC differentiation in number and length. The unlabeled MSTN-Cas9/gRNA4 was transfected into SEFs and monoclonal positive cells was obtained after 48 hours transfection. The MSTN-positive cells were used as donor cells to perform somatic cell nuclear transplantation to produce transgenic sheep. A total of 20 embryos were transplanted into surrogate mothers, four of them normally produce offspring. The genomic DNA of surviving lambs were used as a template, three positive individuals were identified by T7E1 digestion. All the results demonstrated that the CRISPR/Cas9 system has the potential to become an important and applicable gene engineering tool in animal breeding.","sheep","ミオスタチン（MSTN）は、胚の筋肉細胞と成人の筋肉の発達の調節に関与する重要な遺伝子です。筋肉の収量を改善することにより、遺伝子改変動物の生産に応用できる可能性があります。この研究の目的は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）を使用してMSTN遺伝子ノックアウトベクターを構築することです。ノックアウト効率は、ガイドRNA（gRNA）の転写の切断活性、ルシフェラーゼ一本鎖アニーリングアッセイ、T7エンドヌクレアーゼIアッセイ（T7E1）、およびTAクローン配列（10/38）によって、ヒツジ耳線維芽細胞（SEF）で評価されました。そして何よりも、検出により、CRISPR / Cas9を介したMSTNの切断活性が29％に達したことが示されました。MSTN-Cas9 / gRNA4をヒツジ骨格筋衛星細胞（sSMSC）にトランスフェクトし、低血清培地での飢餓によって誘発された筋節形成におけるMSTNの機能を確認しました。結果は、筋管形成効率が、対照群およびノックアウト群において、それぞれ11.2 +/- 1.3％および19.5 +/- 2.1％であることを示した。筋節の平均の長さは22 +/- 5.3および47 +/- 3.6 mumであり、MSTNノックアウトが数と長さのsSMSC分化を促進できることを示しています。非標識MSTN-Cas9 / gRNA4をSEFにトランスフェクトし、48時間のトランスフェクション後にモノクローナル陽性細胞を取得しました。MSTN陽性細胞をドナー細胞として使用し、体細胞核移植を行ってトランスジェニックヒツジを作製した。合計20個の胚が代理母に移植され、そのうち4個は通常子孫を産みます。生き残った子羊のゲノムDNAをテンプレートとして使用し、T7E1消化によって3つの陽性個体を同定しました。すべての結果は、CRISPR / Cas9システムが動物の繁殖において重要で適用可能な遺伝子工学ツールになる可能性があることを示しました。"]
[72,31039970,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","bone morphogenetic protein receptor type 1b","Reproduction, fertility, and development","Generation of gene-edited sheep with a defined Booroola fecundity gene (FecB(B))  mutation in bone morphogenetic protein receptor type 1B (BMPR1B) via clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9.",2018,"30(12):1616-1621","[Zhou S et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China.",31039970,"10.1071/RD18086 ","Since its emergence, the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CRISPR-associated (Cas) 9 system has been increasingly used to generate  animals for economically important traits. However, most CRISPR/Cas9 applications have been focused on non-homologous end joining, which results in base deletions  and insertions, leading to a functional knockout of the targeted gene. The Booroola fecundity gene (FecBB) mutation (p.Q249R) in bone morphogenetic protein  receptor type 1B (BMPR1B) has been demonstrated to exert a profound effect on fecundity in many breeds of sheep. In the present study, we successfully obtained lambs with defined point mutations resulting in a p.249Q>R substitution through the coinjection of Cas9 mRNA, a single guide RNA and single-stranded DNA oligonucleotides into Tan sheep zygotes. In the newborn lambs, the observed efficiency of the single nucleotide exchange was as high as 23.8%. We believe that our findings will contribute to improved reproduction traits in sheep, as well as to the generation of defined point mutations in other large animals.","sheep","その出現以来、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-CRISPR関連（Cas）9システムは、経済的に重要な特性の動物を生成するためにますます使用されています。ただし、ほとんどのCRISPR / Cas9アプリケーションは、非相同末端結合に焦点を合わせており、その結果、塩基の削除と挿入が行われ、標的遺伝子の機能的なノックアウトが発生します。骨形成タンパク質受容体1B型（BMPR1B）のブールーラ繁殖力遺伝子（FecBB）変異（p.Q249R）は、多くの種類の羊の繁殖力に大きな影響を与えることが実証されています。本研究では、Cas9 mRNA、シングルガイドRNA、および一本鎖DNAオリゴヌクレオチドをタンヒツジ接合子に同時注入することにより、p.249Q> R置換をもたらす定義された点変異を有する子羊を首尾よく取得しました。新生子羊では、観察された一塩基交換の効率は23.8％と高かった。私たちの調査結果は、羊の繁殖特性の改善、および他の大型動物の定義された点突然変異の生成に寄与すると信じています。"]
[73,30446691,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","tissue nonspecific alkaline phosphatase","Scientific reports","Genetic engineering a large animal model of human hypophosphatasia in sheep.",2018,"8(1):16945","[Williams DK et al.]","Texas A&M University, College Station, TX, USA.",30446691,"10.1038/s41598-018-35079-y ","The availability of tools to accurately replicate the clinical phenotype of rare  human diseases is a key step toward improved understanding of disease progression and the development of more effective therapeutics. We successfully generated the first large animal model of a rare human bone disease, hypophosphatasia (HPP) using CRISPR/Cas9 to introduce a single point mutation in the tissue nonspecific  alkaline phosphatase (TNSALP) gene (ALPL) (1077 C > G) in sheep. HPP is a rare inherited disorder of mineral metabolism that affects bone and tooth development, and is associated with muscle weakness. Compared to wild-type (WT) controls, HPP  sheep have reduced serum alkaline phosphatase activity, decreased tail vertebral  bone size, and metaphyseal flaring, consistent with the mineralization deficits observed in human HPP patients. Computed tomography revealed short roots and thin dentin in incisors, and reduced mandibular bone in HPP vs. WT sheep, accurately replicating odonto-HPP. Skeletal muscle biopsies revealed aberrant fiber size and disorganized mitochondrial cristae structure in HPP vs. WT sheep. These genetically engineered sheep accurately phenocopy human HPP and provide a novel large animal platform for the longitudinal study of HPP progression, as well as other rare human bone diseases.","sheep","まれな人間の病気の臨床表現型を正確に再現するためのツールの可用性は、病気の進行の理解を深め、より効果的な治療法の開発に向けた重要なステップです。CRISPR / Cas9を使用して、まれなヒト骨疾患である低ホスファターゼ（HPP）の最初の大型動物モデルを生成し、羊の組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNSALP）遺伝子（ALPL）（1077 C> G）に単一点突然変異を導入することに成功しました。 。HPPは、骨や歯の発達に影響を及ぼし、筋肉の衰弱に関連する、まれな遺伝性のミネラル代謝障害です。野生型（WT）コントロールと比較して、HPP羊は、血清アルカリホスファターゼ活性が低下し、尾椎骨サイズが減少し、骨幹端のフレアが発生しました。これは、ヒトHPP患者で観察された石灰化障害と一致しています。コンピュータ断層撮影法は、切開部の短い根と薄い歯状突起、およびHPP対WT羊の下顎骨の減少を明らかにし、歯状突起-HPPを正確に複製しました。骨格筋生検は、HPP対WT羊の異常な繊維サイズと無秩序なミトコンドリアクリステ構造を明らかにしました。これらの遺伝子操作された羊は、ヒトHPPを正確に表現型コピーし、HPPの進行、およびその他のまれなヒトの骨疾患の縦断的研究のための新しい大型動物プラットフォームを提供します。"]
[74,30284144,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","PDX1","Transgenic research","Mosaicism diminishes the value of pre-implantation embryo biopsies for detecting  CRISPR/Cas9 induced mutations in sheep.",2018,"27(6):525-537","[Vilarino M et al.]","University of California Davis, Davis, CA, USA.",30284144,"10.1007/s11248-018-0094-x ","The production of knock-out (KO) livestock models is both expensive and time consuming due to their long gestational interval and low number of offspring. One alternative to increase efficiency is performing a genetic screening to select pre-implantation embryos that have incorporated the desired mutation. Here we report the use of sheep embryo biopsies for detecting CRISPR/Cas9-induced mutations targeting the gene PDX1 prior to embryo transfer. PDX1 is a critical gene for pancreas development and the target gene required for the creation of pancreatogenesis-disabled sheep. We evaluated the viability of biopsied embryos in vitro and in vivo, and we determined the mutation efficiency using PCR combined with gel electrophoresis and digital droplet PCR (ddPCR). Next, we determined the presence of mosaicism in ~ 50% of the recovered fetuses employing  a clonal sequencing methodology. While the use of biopsies did not compromise embryo viability, the presence of mosaicism diminished the diagnostic value of the technique. If mosaicism could be overcome, pre-implantation embryo biopsies for mutation screening represents a powerful approach that will streamline the creation of KO animals.","sheep","ノックアウト（KO）家畜モデルの生産は、妊娠期間が長く、子孫の数が少ないため、費用と時間がかかります。効率を上げるための1つの代替策は、遺伝子スクリーニングを実行して、目的の突然変異を組み込んだ着床前胚を選択することです。ここでは、胚移植前に遺伝子PDX1を標的とするCRISPR / Cas9誘発性変異を検出するための羊胚生検の使用を報告します。PDX1は、膵臓の発達に重要な遺伝子であり、膵臓形成障害のある羊の作成に必要な標的遺伝子です。生検した胚のinvitroおよびinvivoでの生存率を評価し、ゲル電気泳動およびデジタル液滴PCR（ddPCR）と組み合わせたPCRを使用して突然変異効率を決定しました。次に、クローンシーケンシング手法を使用して、回収された胎児の約50％にモザイク現象が存在するかどうかを確認しました。生検の使用は胚の生存率を損なうことはありませんでしたが、モザイク現象の存在は技術の診断的価値を減少させました。モザイク現象を克服できれば、突然変異スクリーニングのための着床前胚生検は、KO動物の作成を合理化する強力なアプローチを表しています。"]
[75,30361373,"animal\n(fish)","african cichlid","CRISPR;Cas9;","agouti-related peptide 2","Science","Agouti-related peptide 2 facilitates convergent evolution of stripe patterns across cichlid fish radiations.",2018,"362(6413):457-460","[Kratochwil CF  et al.]","University of Konstanz, Konstanz, Germany.",30361373,"10.1126/science.aao6809 ","The color patterns of African cichlid fishes provide notable examples of phenotypic convergence. Across the more than 1200 East African rift lake species, melanic horizontal stripes have evolved numerous times. We discovered that regulatory changes of the gene agouti-related peptide 2 (agrp2) act as molecular  switches controlling this evolutionarily labile phenotype. Reduced agrp2 expression is convergently associated with the presence of stripe patterns across species flocks. However, cis-regulatory mutations are not predictive of stripes across radiations, suggesting independent regulatory mechanisms. Genetic mapping  confirms the link between the agrp2 locus and stripe patterns. The crucial role of agrp2 is further supported by a CRISPR-Cas9 knockout that reconstitutes stripes in a nonstriped cichlid. Thus, we unveil how a single gene affects the convergent evolution of a complex color pattern.","fish","アフリカのシクリッド魚の色のパターンは、表現型の収束の注目すべき例を提供します。1200以上の東アフリカの地溝湖種にわたって、メラニンの横縞が何度も進化してきました。遺伝子アグーチ関連ペプチド2（agrp2）の調節変化が、この進化的に不安定な表現型を制御する分子スイッチとして機能することを発見しました。agrp2の発現の低下は、種の群れ全体の縞模様の存在と収束的に関連しています。ただし、シス調節変異は、放射線全体の縞模様を予測するものではなく、独立した調節メカニズムを示唆しています。遺伝子マッピングは、agrp2遺伝子座とストライプパターンの間のリンクを確認します。agrp2の重要な役割は、縞模様のな​​いシクリッドの縞模様を再構成するCRISPR-Cas9ノックアウトによってさらにサポートされます。したがって、単一の遺伝子が複雑な色パターンの収斂進化にどのように影響するかを明らかにします。"]
[76,29555241,"animal\n(fish)","Astyanax mexicanus","CRISPR;Cas9;","oculocutaneous albinism II (oca2)","Developmental biology","CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax  mexicanus.",2018,"441(2):313-318","[Klaassen H et al.]","Iowa State University, Ames, IA, USA.",29555241,"10.1016/j.ydbio.2018.03.014 ","Understanding the genetic basis of trait evolution is critical to identifying the mechanisms that generated the immense amount of diversity observable in the living world. However, genetically manipulating organisms from natural populations with evolutionary adaptations remains a significant challenge. Astyanax mexicanus exists in two interfertile forms, a surface-dwelling form and  multiple independently evolved cave-dwelling forms. Cavefish have evolved a number of morphological and behavioral traits and multiple quantitative trait loci (QTL) analyses have been performed to identify loci underlying these traits. These studies provide a unique opportunity to identify and test candidate genes for these cave-specific traits. We have leveraged the CRISPR/Cas9 genome editing  techniques to characterize the effects of mutations in oculocutaneous albinism II (oca2), a candidate gene hypothesized to be responsible for the evolution of albinism in A. mexicanus cave populations. We generated oca2 mutant surface A. mexicanus. Surface fish with oca2 mutations are albino due to a disruption in the first step of the melanin synthesis pathway, the same step that is disrupted in albino cavefish. Hybrid offspring from crosses between oca2 mutant surface and cavefish are albino, definitively demonstrating the role of this gene in the evolution of albinism in this species. This research elucidates the role oca2 plays in pigmentation in fish, and establishes that this gene is solely responsible for the evolution of albinism in multiple cavefish populations. Finally, it demonstrates the utility of using genome editing to investigate the genetic basis of trait evolution.","fish","形質進化の遺伝的基盤を理解することは、生きている世界で観察可能な膨大な量の多様性を生み出したメカニズムを特定するために重要です。ただし、進化的適応を伴う自然集団からの生物を遺伝的に操作することは、依然として重要な課題です。Astyanax mexicanusは、表面に生息する形態と、独立して進化した複数の洞窟に生息する形態の2つの干渉形態で存在します。Cavefishは、多くの形態学的および行動的形質を進化させ、これらの形質の根底にある遺伝子座を特定するために、複数の量的形質遺伝子座（QTL）分析が実行されました。これらの研究は、これらの洞窟特有の特徴の候補遺伝子を特定してテストするユニークな機会を提供します。CRISPR / Cas9ゲノム編集技術を活用して、A。mexicanus洞窟集団の白皮症の進化に関与すると仮定されている候補遺伝子である眼皮膚白皮症II（oca2）の変異の影響を特徴付けました。oca2変異体表面A.mexicanusを生成しました。oca2変異を持つ表面の魚は、メラニン合成経路の最初のステップでの破壊のためにアルビノです。これは、アルビノの洞窟魚で破壊されるのと同じステップです。oca2変異体表面と洞窟魚の間の交配からのハイブリッド子孫はアルビノであり、この種の白皮症の進化におけるこの遺伝子の役割を明確に示しています。この研究は、oca2が魚の色素沈着に果たす役割を解明し、この遺伝子が複数の洞窟魚の個体群における白皮症の進化に単独で関与していることを立証しています。最後に、形質進化の遺伝的基盤を調査するためにゲノム編集を使用することの有用性を示しています。"]
[77,30405210,"animal\n(fish)","channel catfish","CRISPR;Cas9;","toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1); rhamnose binding lectin (RBL) ","Scientific reports","Effects of CRISPR/Cas9 dosage on TICAM1 and RBL gene mutation rate, embryonic development, hatchability and fry survival in channel catfish.",2018,"8(1):16499","[Elaswad A et al.]","Auburn University, AL, USA.",30405210,"10.1038/s41598-018-34738-4 ","The current study was conducted to assess the effects of microinjection of different dosages of guide RNA (gRNA)/Cas9 protein on the mutation rate, embryo survival, embryonic development, hatchability and early fry survival in channel catfish, Ictalurus punctatus. Guide RNAs targeting two of the channel catfish immune-related genes, toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) and rhamnose binding lectin (RBL) genes, were designed and prepared. Three dosages of gRNA/Cas9 protein (low, 2.5 ng gRNA/7.5 ng Cas9, medium, 5 ng gRNA/15 ng Cas9 and high, 7.5 ng gRNA/22.5 ng Cas9) were microinjected into the yolk of one-cell embryos. Mutation rate increased with higher dosages (p < 0.05). Higher dosages increased the mutation frequency in individual embryos where biallelic mutations were detected. For both genes, microinjection procedures increased the embryo mortality (p < 0.05). Increasing the dosage of gRNA/Cas9 protein increased the embryo mortality and reduced the hatching percent (p < 0.05). Embryonic development was delayed when gRNAs targeting RBL gene were injected. Means of fry survival time were similar for different dosages (p > 0.05). The current results lay the foundations for designing gene editing experiments in channel catfish and can be used as a guide  for other fish species.","fish","現在の研究は、アメリカナマズIctalurus punctatusの突然変異率、胚の生存、胚発生、孵化率、および稚魚の早期生存に対する、さまざまな投与量のガイドRNA（gRNA）/ Cas9タンパク質のマイクロインジェクションの影響を評価するために実施されました。アメリカナマズの免疫関連遺伝子の2つであるトール/インターロイキン1受容体ドメイン含有アダプター分子（TICAM 1）とラムノース結合レクチン（RBL）遺伝子を標的とするガイドRNAを設計し、調製しました。3回分のgRNA / Cas9タンパク質（低、2.5 ng gRNA / 7.5 ng Cas9、中、5 ng gRNA / 15 ng Cas9および高、7.5 ng gRNA / 22.5 ng Cas9）を1細胞胚の卵黄にマイクロインジェクションしました。突然変異率は、投与量が多いほど増加しました（p <0.05）。より高い投与量は、二対立遺伝子突然変異が検出された個々の胚の突然変異頻度を増加させました。両方の遺伝子について、マイクロインジェクション手順は胚の死亡率を増加させました（p <0.05）。gRNA / Cas9タンパク質の投与量を増やすと、胚の死亡率が上がり、孵化率が下がりました（p <0.05）。RBL遺伝子を標的とするgRNAを注入すると、胚発生が遅れました。稚魚の生存時間の平均は、異なる投与量で類似していた（p> 0.05）。現在の結果は、アメリカナマズの遺伝子編集実験を設計するための基礎を築き、他の魚種のガイドとして使用することができます。"]
[78,29443028,"animal\n(fish)","channel catfish (Ictalurus punctatus)","CRISPR;Cas9;","toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1); rhamnose binding lectin (RBL) ","Journal of visualized experiments","Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus,  Embryos for Gene Editing.",2018,"(131)","[Elaswad A et al.]","Auburn University, USA.",29443028,"10.3791/56275 ","The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The  clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol  for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide  RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due  to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.","fish","アメリカナマズIctaluruspunctatusの完全なゲノムが配列決定されており、アメリカナマズの遺伝子機能を研究する機会が増えています。遺伝子ノックアウトは、これらの遺伝子機能をinvivoで研究するために使用されてきました。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）システムは、ゲノムDNA配列を編集して遺伝子機能を変更するために使用される強力なツールです。従来のアプローチは、マイクロインジェクションを介してCRISPR / Cas9 mRNAを単一細胞胚に導入することでしたが、これはナマズでは遅くて非効率的なプロセスになる可能性があります。ここでは、CRISPR / Cas9タンパク質を用いたアメリカナマズ胚のマイクロインジェクションの詳細なプロトコルについて説明します。簡単に言うと、卵子と精子を集めて人工授精を行いました。受精卵をホルトフレッター液の入ったペトリ皿に移しました。注入量を較正し、トール/インターロイキン1受容体ドメイン含有アダプター分子（TICAM 1）遺伝子およびラムノース結合レクチン（RBL）遺伝子を標的とするガイドRNA / Cas9を1細胞胚の卵黄にマイクロ注入しました。インデルがDNAシーケンシングによって確認されたため、遺伝子ノックアウトは成功しました。これらの突然変異による予測されるタンパク質配列の変化には、フレームシフトおよび時期尚早の終止コドンによる切断されたタンパク質が含まれていました。"]
[79,30220031,"animal\n(fish)","common carp","CRISPR;Cas9;","HIF-1 alpha","Archives of virology","CRISPR/Cas9-mediated knockout of HIF-1alpha gene in epithelioma papulosum cyprini (EPC) cells inhibited apoptosis and viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) growth.",2018,"163(12):3395-3402","[Kim MS et al.]","Sejong University, Seoul, Korea.",30220031,"10.1007/s00705-018-4018-0 ","Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a heterodimer of HIF-1alpha and HIF-1beta,  and its key role in the regulation of cellular responses to hypoxia has been well-demonstrated. The participation of HIF-1alpha in apoptosis has been reported in mammals, however, a little information is available on the role of HIF-1alpha  in the progression of apoptosis in fish. In this study, to know the role of HIF-1alpha in the apoptosis of fish cells, we produced HIF-1alpha knockout Epithelioma papulosum cyprini (EPC) cells using a CRISPR/Cas9 vector, and a single cell clone showing a heterozygous insertion/deletion (indel) mutation (one nucleotide insertion and one nucleotide deletion in HIF-1alpha gene) was chosen for further experiments. To confirm the knockout of HIF-1alpha, cells were transfected with a hypoxia reporting vector containing hypoxic response elements  (HREs). EPC cells transfected with the reporting plasmids showed significantly increased luminescence by exposure to cobalt chloride, a prolyl hydroxylases inhibitor. On the other hand, HIF-1alpha knockout EPC cells showed a non-responsiveness to a cobalt chloride exposure, suggesting that functional HIF-1alpha protein was not produced in the HIF-1alpha knockout EPC cells. Apoptosis progression induced by camptothecin and viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) infection was severely inhibited by HIF-1alpha knockout, and the replication of VHSV was significantly retarded in HIF-1alpha knockout EPC cells.  These results suggest that HIF-1alpha in EPC cells acts as a pro-apoptotic factor in the progression of apoptosis triggered by a DNA damaging agent and rhabdoviral infection.","fish","低酸素誘導因子-1（HIF-1）は、HIF-1alphaとHIF-1betaのヘテロダイマーであり、低酸素に対する細胞応答の調節におけるその重要な役割が十分に実証されています。アポトーシスへのHIF-1alphaの関与は哺乳類で報告されていますが、魚のアポトーシスの進行におけるHIF-1alphaの役割に関する情報はほとんどありません。この研究では、魚細胞のアポトーシスにおけるHIF-1alphaの役割を知るために、CRISPR / Cas9ベクターとヘテロ接合性の挿入/欠失を示す単一細胞クローンを使用して、HIF-1alphaノックアウトEpithelioma papulosum cyprini（EPC）細胞を作製しました。 （インデル）突然変異（HIF-1alpha遺伝子の1つのヌクレオチド挿入と1つのヌクレオチド欠失）は、さらなる実験のために選ばれました。HIF-1alphaのノックアウトを確認するために、低酸素応答要素（HRE）を含む低酸素レポートベクターを細胞にトランスフェクトしました。報告プラスミドでトランスフェクトされたEPC細胞は、プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤である塩化コバルトへの曝露により、発光の有意な増加を示しました。一方、HIF-1alphaノックアウトEPC細胞は、塩化コバルト曝露に対して非応答性を示し、機能的なHIF-1alphaタンパク質がHIF-1alphaノックアウトEPC細胞で産生されなかったことを示唆しています。カンプトテシンおよびウイルス性出血性敗血症ウイルス（VHSV）感染によって誘導されるアポトーシスの進行は、HIF-1alphaノックアウトによって大幅に抑制され、VHSVの複製はHIF-1alphaノックアウトEPC細胞で大幅に遅延しました。これらの結果は、EPC細胞のHIF-1alphaが、DNA損傷剤とラブドウイルス感染によって引き起こされるアポトーシスの進行においてアポトーシス促進因子として作用することを示唆しています。"]
[80,30244086,"animal\n(fish)","common carp","CRISPR;Cas9;","IFN regulatory factor 9 (IRF9)","Fish & shellfish immunology","Increase of viral hemorrhagic septicemia virus growth by knockout of IRF9 gene in Epithelioma papulosum cyprini cells.",2018,"83:443-448","[Kim MS et al.]","Sejong University, Seoul, Korea.",30244086,"10.1016/j.fsi.2018.09.025 ","Viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) has been a notorious pathogen in freshwater and marine fish. Due to the lack of effective treatment measures against VHSV disease, the development of prophylactic vaccines has been required, and methods that can produce high-titered viruses would be advantageous in producing cost-effective vaccines. Type I interferon (IFN) responses are the key  elements of vertebrates' antiviral activities, and IFN-stimulated gene factor 3 (ISGF3) complex formed through type I IFNs up-regulates the expression of IFN-stimulated genes (ISGs). IFN regulatory factor 9 (IRF9) is a key component of ISGF3, so the inhibition of IRF9 would compromise host's type I IFN responses, which would weaken host antiviral activity. In this study, to increase the replication of VHSV, we generated IRF9 knockout Epithelioma papulosum cyprini (EPC) cells using a CRISPR/Cas9 vector that contains an EPC cell's U6 promoter-driven guide RNA cassette (targeting IRF9 gene) and a Cas9 expressing cassette. In the clones of IRF9 knockout EPC cells, there were no increase in ISG15 gene by poly I:C, and in Mx1 gene by both poly I:C and VHSV. Interestingly, although the increased folds were conspicuously lower than control EPC cells, the expression of ISG 15 gene in all the IRF9 knockout clones was significantly increased by VHSV infection. Control EPC cells pre-treated with poly I:C did not  show any CPE when infected with VHSV, however, IRF9 knockout EPC cells showed CPE by VHSV infection in spite of being pretreated with poly I:C. The replication of  VHSV in IRF9 knockout EPC cells was significantly faster and higher than that in  control EPC cells indicating that the IRF9 knockout-mediated decrease of type I IFN responses allowed VHSV to replicate efficiently. Considering an economical aspect for the production of fish vaccines, the present IRF9 knockout EPC cells can be used to get higher-titered VHSV.","fish","ウイルス性出血性敗血症ウイルス（VHSV）は、淡水魚および海産魚の悪名高い病原体です。VHSV疾患に対する効果的な治療法がないため、予防ワクチンの開発が必要であり、高力価ウイルスを産生できる方法は、費用効果の高いワクチンを産生する上で有利であろう。I型インターフェロン（IFN）応答は脊椎動物の抗ウイルス活性の重要な要素であり、I型IFNを介して形成されるIFN刺激遺伝子因子3（ISGF3）複合体は、IFN刺激遺伝子（ISG）の発現をアップレギュレートします。IFN調節因子9（IRF9）はISGF3の重要な要素であるため、IRF9を阻害すると、宿主のI型IFN応答が損なわれ、宿主の抗ウイルス活性が弱まります。この研究では、VHSVの複製を増やすために、EPC細胞のU6プロモーター駆動ガイドRNAカセット（IRF9遺伝子を標的とする）とCas9発現カセットを含むCRISPR / Cas9ベクターを使用してIRF9ノックアウトEpitheliomapapulosum cyprini（EPC）細胞を生成しました。IRF9ノックアウトEPC細胞のクローンでは、ポリI：CによるISG15遺伝子の増加、およびポリI：CとVHSVの両方によるMx1遺伝子の増加はありませんでした。興味深いことに、増加した倍数は対照EPC細胞よりも著しく低かったが、すべてのIRF9ノックアウトクローンにおけるISG15遺伝子の発現はVHSV感染によって有意に増加した。ポリI：Cで前処理された対照EPC細胞は、VHSVに感染したときにCPEを示さなかったが、IRF9ノックアウトEPC細胞は、ポリI：Cで前処理されたにもかかわらず、VHSV感染によるCPEを示した。IRF9ノックアウトEPC細胞におけるVHSVの複製は、対照EPC細胞よりも有意に速く、より高く、IRF9ノックアウトを介したI型IFN応答の減少により、VHSVが効率的に複製できることを示しています。魚用ワクチンの製造における経済的側面を考慮すると、現在のIRF9ノックアウトEPC細胞を使用して、より高力価のVHSVを得ることができます。"]
[81,30323353,"animal\n(fish)","Danionella translucida","CRISPR;Cas9;"," ","Nature methods","Transparent Danionella translucida as a genetically tractable vertebrate brain model.",2018,"15(11):977-983","[Schulze L et al.]","Charite-Universitatsmedizin Berlin, Berlin, Germany.",30323353,"10.1038/s41592-018-0144-6 ","Understanding how distributed neuronal circuits integrate sensory information and generate behavior is a central goal of neuroscience. However, it has been difficult to study neuronal networks at single-cell resolution across the entire  adult brain in vertebrates because of their size and opacity. We address this challenge here by introducing the fish Danionella translucida to neuroscience as  a potential model organism. This teleost remains small and transparent even in adulthood, when neural circuits and behavior have matured. Despite having the smallest known adult vertebrate brain, D. translucida displays a rich set of complex behaviors, including courtship, shoaling, schooling, and acoustic communication. In order to carry out optical measurements and perturbations of neural activity with genetically encoded tools, we established CRISPR-Cas9 genome editing and Tol2 transgenesis techniques. These features make D. translucida a promising model organism for the study of adult vertebrate brain function at single-cell resolution.","fish","分散型神経回路がどのように感覚情報を統合し、行動を生成するかを理解することは、神経科学の中心的な目標です。ただし、脊椎動物の成人の脳全体にわたる単一細胞の解像度でニューロンネットワークを研究することは、そのサイズと不透明性のために困難でした。ここでは、潜在的なモデル生物として魚のDanionellatranslucidaを神経科学に紹介することでこの課題に取り組んでいます。このテレオストは、神経回路と行動が成熟した成人期でも小さく透明なままです。D. translucidaは、既知の最小の成人脊椎動物の脳を持っているにもかかわらず、求愛、群れ、学校教育、音響コミュニケーションなど、複雑な行動の豊富なセットを示しています。遺伝的にコード化されたツールを使用して神経活動の光学的測定と摂動を実行するために、CRISPR-Cas9ゲノム編集とTol2遺伝子導入技術を確立しました。これらの機能により、D。translucidaは、単一細胞の解像度で成体の脊椎動物の脳機能を研究するための有望なモデル生物になっています。"]
[82,29477498,"animal\n(fish)","grass carp (Ctenopharyngodon idellus)","CRISPR;Cas9;","Junctional Adhesion Molecule-A (gcJAM-A) ","Fish & shellfish immunology","Efficient resistance to grass carp reovirus infection in JAM-A knockout cells using CRISPR/Cas9.",2018,"76:206-215","[Ma J et al.]","Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan, Hubei, China.",29477498,"10.1016/j.fsi.2018.02.039 ","The hemorrhagic disease of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) induced by grass carp reovirus (GCRV) leads to huge economic losses in China and currently, there  are no effective methods available for prevention and treatment. The various GCRV genotypes may be one of the major obstacles in the pursuit of an effective antiviral treatment. In this study, we exploited CRISPR/Cas9 gene editing to specifically knockout the DNA sequence of the grass carp Junctional Adhesion Molecule-A (gcJAM-A) and evaluated in vitro resistance against various GCRV genotypes. Our results show that CRISPR/Cas9 effectively knocked out gcJAM-A and  reduced GCRV infection for two different genotypes in permissive grass carp kidney cells (CIK), as evidenced by suppressed cytopathic effect (CPE) and GCRV progeny production in infected cells. In addition, with ectopic expression of gcJAM-A in cells, non-permissive cells derived from Chinese giant salamander (Andrias davidianus) muscle (GSM) could be highly infected by both GCRV-JX0901 and Hubei grass carp disease reovirus (HGDRV) strains that have different genotypes. Taken together, the results demonstrate that gcJAM-A is necessary for  GCRV infection, implying a potential approach for viral control in aquaculture.","fish","ソウギョレオウイルス（GCRV）によって引き起こされるソウギョ（Ctenopharyngodon idellus）の出血性疾患は、中国で莫大な経済的損失をもたらし、現在、予防と治療に利用できる効果的な方法はありません。さまざまなGCRV遺伝子型は、効果的な抗ウイルス治療を追求する上での主要な障害の1つである可能性があります。この研究では、CRISPR / Cas9遺伝子編集を利用して、ソウギョの接合接着分子-A（gcJAM-A）のDNA配列を特異的にノックアウトし、さまざまなGCRV遺伝子型に対するinvitro耐性を評価しました。私たちの結果は、CRISPR / Cas9がgcJAM-Aを効果的にノックアウトし、感染細胞における抑制された細胞変性効果（CPE）とGCRV子孫産生によって証明されるように、許容ソウギョ腎臓細胞（CIK）の2つの異なる遺伝子型のGCRV感染を減少させたことを示しています。さらに、細胞内でのgcJAM-Aの異所性発現により、チュウゴクオオサンショウウオ（Andrias davidianus）の筋肉（GSM）に由来する非許容細胞は、GCRV-JX0901株と湖北草鯉病レオウイルス（HGDRV）株の両方に高度に感染する可能性があります。異なる遺伝子型を持っています。まとめると、結果は、gcJAM-AがGCRV感染に必要であることを示しており、水産養殖におけるウイルス制御の潜在的なアプローチを示唆しています。"]
[83,30072445,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;"," ","Biology open","Efficient genome editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein approach in cultured Medaka fish cells.",2018,"7(8)","[Liu Q et al.]","National University of Singapore, Singapore.",30072445,"10.1242/bio.035170 ","Gene editing with CRISPR/Cas9 is a powerful tool to study the function of target  genes. Although this technology has demonstrated wide efficiency in many species, including fertilized zebrafish and medaka fish embryos when microinjected, its application to achieve efficient gene editing in cultured fish cells have met some difficulty. Here, we report an efficient and reliable approach to edit genes in cultured medaka (Oryzias latipes) fish cells using pre-formed gRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complex. Both medaka fish haploid and diploid cells were  transfected with the RNP complex by electroporation. Efficient gene editing was demonstrated by polymerase chain reaction (PCR) amplification of the target gene  from genomic DNA and heteroduplex mobility assay carried out with polyacrylamide  gel electrophoresis (PAGE). The heteroduplex bands caused by RNP cleavage and non-homologous end joining could be readily detected by PAGE. DNA sequencing confirmed that these heteroduplex bands contains the mutated target gene sequence. The average gene editing efficiency in haploid cells reached 50%, enabling us to generate a clonal cell line with ntrk3b gene mutation for further  study. This RNP transfection method also works efficiently in diploid medaka cells, with the highest mutation efficiency of 61.5%. The specificity of this synthetic RNP CRISPR/Cas9 approach was verified by candidate off-target gene sequencing. Our result indicated that transfection of pre-formed gRNA-Cas9 RNP into fish cells is efficient and reliable to edit target genes in cultured medaka fish cells. This method will be very useful for gene function studies using cultured fish cells.","fish","CRISPR / Cas9による遺伝子編集は、標的遺伝子の機能を研究するための強力なツールです。この技術は、マイクロインジェクションによるゼブラフィッシュの受精やメダカの胚など、多くの種で幅広い効率を示していますが、培養魚細胞で効率的な遺伝子編集を実現するための応用にはいくつかの困難があります。ここでは、事前に形成されたgRNA-Cas9リボ核タンパク質（RNP）複合体を使用して、培養メダカ（Oryzias latipes）魚細胞の遺伝子を編集するための効率的で信頼性の高いアプローチを報告します。メダカの一倍体細胞と二倍体細胞の両方に、エレクトロポレーションによってRNP複合体をトランスフェクトしました。効率的な遺伝子編集は、ゲノムDNAからの標的遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で実行されるヘテロ二本鎖移動度アッセイによって実証されました。RNP切断および非相同末端結合によって引き起こされるヘテロ二本鎖バンドは、PAGEによって容易に検出できます。DNA配列決定により、これらのヘテロ二本鎖バンドに変異した標的遺伝子配列が含まれていることが確認されました。一倍体細胞の平均遺伝子編集効率は50％に達し、さらなる研究のためにntrk3b遺伝子変異を有するクローン細胞株を生成することができました。このRNPトランスフェクション法は二倍体メダカ細胞でも効率的に機能し、最高の変異効率は61.5％です。この合成RNPCRISPR / Cas9アプローチの特異性は、候補のオフターゲット遺伝子シーケンシングによって検証されました。我々の結果は、事前に形成されたgRNA-Cas9 RNPの魚細胞へのトランスフェクションが、培養メダカ魚細胞の標的遺伝子を編集するのに効率的で信頼できることを示した。この方法は、養殖魚細胞を用いた遺伝子機能研究に非常に役立ちます。"]
[84,29873175,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;","tyr","Journal of experimental zoology. Part B, Molecular and developmental evolution","Generation of albino medaka (Oryzias latipes) by CRISPR/Cas9.",2018,"330(4):242-246","[Fang J et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China.",29873175,"10.1002/jez.b.22808 ","CRISPR/Cas9 system is a powerful tool to produce the genetic modification in plants and animals such as mouse and zebrafish. However, this technique was less  reported in fish model medaka (Oryzias latipes). Here, we describe an efficient and rapid procedure for genome editing in medaka tyr and generate a stable albino strain. The Cas9 mRNA and gRNA for tyr gene were injected into the embryos of orange-red medaka, and the tyr gene was disrupted in more than 90% of embryos in  F0 and F1, which were validated by observation and sequencing of targeted locus.  The pigment cells were largely decreased in the mutant medaka because open reading frames of tyr were shifted near the targeted locus, generating albino medaka. Taken together, this method provides a detailed procedure to generate the genetic modification medaka by using an optimized CRISPR/Cas9 system, and the new albino medaka provides an important research platform to study the pigmentation.","fish","CRISPR / Cas9システムは、マウスやゼブラフィッシュなどの植物や動物に遺伝子組み換えを行うための強力なツールです。しかし、この手法はメダカ（Oryzias latipes）ではあまり報告されていません。ここでは、メダカtyrのゲノム編集の効率的かつ迅速な手順を説明し、安定したアルビノ株を生成します。tyr遺伝子のCas9mRNAとgRNAをオレンジレッドメダカの胚に注入し、F0とF1の胚の90％以上でtyr遺伝子が破壊され、標的遺伝子座の観察と配列決定によって検証されました。変異メダカでは、tyrのオープンリーディングフレームがターゲット遺伝子座の近くにシフトし、アルビノメダカが生成されたため、色素細胞が大幅に減少しました。まとめると、この方法は、最適化されたCRISPR / Cas9システムを使用して遺伝子組み換えメダカを生成するための詳細な手順を提供し、新しいアルビノメダカは色素沈着を研究するための重要な研究プラットフォームを提供します。"]
[85,29556077,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;","ZRS","Nature genetics","A conserved Shh cis-regulatory module highlights a common developmental origin of unpaired and paired fins.",2018,"50(4):504-509","[Letelier J  et al.]","Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo (CABD), Consejo Superior de Investigaciones Cientificas/Universidad Pablo de Olavide/Junta de Andalucia, Sevilla, Spain.",29556077,"10.1038/s41588-018-0080-5 ","Despite their evolutionary, developmental and functional importance, the origin of vertebrate paired appendages remains uncertain. In mice, a single enhancer termed ZRS is solely responsible for Shh expression in limbs. Here, zebrafish and mouse transgenic assays trace the functional equivalence of ZRS across the gnathostome phylogeny. CRISPR/Cas9-mediated deletion of the medaka (Oryzias latipes) ZRS and enhancer assays identify the existence of ZRS shadow enhancers in both teleost and human genomes. Deletion of both ZRS and shadow ZRS abolishes  shh expression and completely truncates pectoral fin formation. Strikingly, deletion of ZRS results in an almost complete ablation of the dorsal fin. This finding indicates that a ZRS-Shh regulatory module is shared by paired and median fins and that paired fins likely emerged by the co-option of developmental programs established in the median fins of stem gnathostomes. Shh function was later reinforced in pectoral fin development with the recruitment of shadow enhancers, conferring additional robustness.","fish","それらの進化的、発達的および機能的重要性にもかかわらず、脊椎動物の対の付属肢の起源は不確かなままです。マウスでは、ZRSと呼ばれる単一のエンハンサーが手足のShh発現に単独で関与しています。ここでは、ゼブラフィッシュとマウスのトランスジェニックアッセイは、顎口上綱の系統発生全体でZRSの機能的同等性を追跡します。CRISPR / Cas9を介したメダカ（Oryzias latipes）のZRSおよびエンハンサーアッセイの削除により、硬骨魚とヒトの両方のゲノムにZRSシャドウエンハンサーが存在することが確認されます。ZRSとシャドウZRSの両方を削除すると、shhの発現がなくなり、胸鰭の形成が完全に切り捨てられます。驚くべきことに、ZRSを削除すると、背鰭がほぼ完全に切除されます。この発見は、ZRS-Shh調節モジュールが対になった鰭と中央値の鰭によって共有され、対になった鰭が茎の顎口上綱の中央値の鰭で確立された発達プログラムの共同選択によって出現した可能性があることを示しています。Shh機能は、後にシャドウエンハンサーの採用により胸鰭の発達で強化され、さらなる堅牢性をもたらしました。"]
[86,30199527,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;","miR-202","PLoS genetics","MiR-202 controls female fecundity by regulating medaka oogenesis.",2018,"14(9):e1007593","[Gay S et al.]","INRA, Rennes, France.",30199527,"10.1371/journal.pgen.1007593 ","Female gamete production relies on coordinated molecular and cellular processes that occur in the ovary throughout oogenesis. In fish, as in other vertebrates, these processes have been extensively studied both in terms of endocrine/paracrine regulation and protein expression and activity. The role of small non-coding RNAs in the regulation of animal reproduction remains however largely unknown and poorly investigated, despite a growing interest for the importance of miRNAs in a wide variety of biological processes. Here, we analyzed the role of miR-202, a miRNA predominantly expressed in male and female gonads in several vertebrate species. We studied its expression in the medaka ovary and generated a mutant line (using CRISPR/Cas9 genome editing) to determine its importance for reproductive success with special interest for egg production. Our results show that miR-202-5p is the most abundant mature form of the miRNA and that it is expressed in granulosa cells and in the unfertilized egg. The knock out (KO) of mir-202 gene resulted in a strong phenotype both in terms of number and quality of eggs produced. Mutant females exhibited either no egg production or produced a dramatically reduced number of eggs that could not be fertilized, ultimately leading to no reproductive success. We quantified the size distribution of the oocytes in the ovary of KO females and performed a large-scale transcriptomic analysis approach to identified dysregulated molecular pathways. Together, cellular and molecular analyses indicate that the lack of miR-202 impairs the early steps of oogenesis/folliculogenesis and decreases the number of large (i.e. vitellogenic) follicles, ultimately leading to dramatically reduced female fecundity. This study sheds new light on the regulatory mechanisms that control the early steps of follicular development, including possible targets of miR-202-5p, and provides the first in vivo functional evidence that a  gonad-predominant microRNA may have a major role in female reproduction.","fish","女性の配偶子の生産は、卵形成を通して卵巣で発生する協調的な分子および細胞プロセスに依存しています。魚では、他の脊椎動物と同様に、これらのプロセスは、内分泌/傍分泌調節とタンパク質の発現および活性の両方の観点から広く研究されてきました。しかし、動物の生殖の調節における小さな非コードRNAの役割は、多種多様な生物学的プロセスにおけるmiRNAの重要性への関心が高まっているにもかかわらず、ほとんど知られていないため、十分に調査されていません。ここでは、いくつかの脊椎動物種の男性と女性の性腺で主に発現するmiRNAであるmiR-202の役割を分析しました。メダカ卵巣での発現を研究し、変異株を生成して（CRISPR / Cas9ゲノム編集を使用）、産卵に特に関心を持って繁殖成功への重要性を判断しました。私たちの結果は、miR-202-5pがmiRNAの最も豊富な成熟型であり、顆粒膜細胞と未受精卵で発現していることを示しています。mir-202遺伝子のノックアウト（KO）は、産卵数と産卵品質の両方の点で強い表現型をもたらしました。突然変異した雌は、産卵しないか、受精できない卵の数が劇的に減少し、最終的には繁殖に成功しませんでした。KO雌の卵巣における卵母細胞のサイズ分布を定量化し、大規模なトランスクリプトーム解析アプローチを実行して、調節不全の分子経路を特定しました。一緒に、細胞および分子分析は、miR-202の欠如が卵形成/卵胞形成の初期段階を損ない、大きな（すなわち卵胞形成）卵胞の数を減らし、最終的に女性の繁殖力を劇的に低下させることを示しています。この研究は、miR-202-5pの可能な標的を含む、濾胞発達の初期段階を制御する調節メカニズムに新たな光を当て、性腺優位のマイクロRNAが女性の生殖に主要な役割を果たす可能性があるという最初のinvivo機能的証拠を提供します。"]
[87,29445519,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;","5 genetic loci","Zoological letters","Highly efficient generation of knock-in transgenic medaka by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.",2018,"4:3","[Watakabe I et al.]","National Institute for Basic Biology, Okazaki, Aichi, Japan.",29445519,"10.1186/s40851-017-0086-3 ","Background: Medaka (Oryzias latipes) is a popular animal model used in vertebrate genetic analysis. Recently, an efficient (~ 30%) knock-in system via non-homologous end joining (NHEJ) was established in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. If the same technique were applicable in medaka, it would greatly expand the usefulness of this model organism. The question of the applicability of CRISPR/Cas9 in medaka, however, has yet to be addressed. Results: We report the highly efficient generation of knock-in transgenic medaka  via non-homologous end joining (NHEJ). Donor plasmid containing a heat-shock promoter and a reporter gene was co-injected with a short guide RNA (sgRNA) targeted for genome digestion, an sgRNA targeted for donor plasmid digestion, and Cas9 mRNA. Broad transgene expression in the expression domain of a target gene was observed in approximately 25% of injected embryos. By raising these animals,  we established stable knock-in transgenic fish with several different constructs  for five genetic loci, obtaining transgenic founders at efficiencies of > 50% for all five loci. Further, we show that the method is useful for obtaining mutant alleles. In the experiments where transgene integrations were targeted between the transcription start site and the initiation methionine, the resultant transgenic fish became mutant alleles. Conclusion: With its simplicity, design flexibility, and high efficiency, we propose that CRISPR/Cas9-mediated knock-in via NHEJ will become a standard method for the generation of transgenic and mutant medaka.","fish","背景：メダカ（Oryzias latipes）は、脊椎動物の遺伝子解析で使用される人気のある動物モデルです。最近、非相同末端結合（NHEJ）を介した効率的な（約30％）ノックインシステムが、CRISPR / Cas9システムを使用してゼブラフィッシュに確立されました。同じ手法がメダカに適用できれば、このモデル生物の有用性が大幅に広がります。しかし、メダカにおけるCRISPR / Cas9の適用可能性の問題はまだ解決されていません。結果：非相同末端結合（NHEJ）を介したノックイントランスジェニックメダカの非常に効率的な生成を報告します。ヒートショックプロモーターとレポーター遺伝子を含むドナープラスミドに、ゲノム消化を標的としたショートガイドRNA（sgRNA）、ドナープラスミド消化を標的としたsgRNA、Cas9mRNAを同時注入しました。標的遺伝子の発現ドメインにおける広範な導入遺伝子の発現は、注入された胚の約25％で観察されました。これらの動物を飼育することにより、5つの遺伝子座に対していくつかの異なるコンストラクトを持つ安定したノックイントランスジェニック魚を確立し、5つの遺伝子座すべてに対して> 50％の効率でトランスジェニック創始者を獲得しました。さらに、この方法が変異対立遺伝子の取得に有用であることを示します。導入遺伝子の組み込みが転写開始部位と開始メチオニンの間で標的とされた実験では、得られたトランスジェニック魚は突然変異対立遺伝子になった。結論：そのシンプルさ、設計の柔軟性、および高効率により、NHEJを介したCRISPR / Cas9を介したノックインが、トランスジェニックおよび変異メダカの生成の標準的な方法になることを提案します。"]
[88,29621239,"animal\n(fish)","medaka; zebrafish","CRISPR;Cas9;TALENs;","sox5; sox10","PLoS genetics","Distinct interactions of Sox5 and Sox10 in fate specification of pigment cells in medaka and zebrafish.",2018,"14(4):e1007260","[Nagao Y et al.]","Nagoya University, Nagoya, Aichi, Japan.",29621239,"10.1371/journal.pgen.1007260 ","Mechanisms generating diverse cell types from multipotent progenitors are fundamental for normal development. Pigment cells are derived from multipotent neural crest cells and their diversity in teleosts provides an excellent model for studying mechanisms controlling fate specification of distinct cell types. Zebrafish have three types of pigment cells (melanocytes, iridophores and xanthophores) while medaka have four (three shared with zebrafish, plus leucophores), raising questions about how conserved mechanisms of fate specification of each pigment cell type are in these fish. We have previously shown that the Sry-related transcription factor Sox10 is crucial for fate specification of pigment cells in zebrafish, and that Sox5 promotes xanthophores  and represses leucophores in a shared xanthophore/leucophore progenitor in medaka. Employing TILLING, TALEN and CRISPR/Cas9 technologies, we generated medaka and zebrafish sox5 and sox10 mutants and conducted comparative analyses of their compound mutant phenotypes. We show that specification of all pigment cells, except leucophores, is dependent on Sox10. Loss of Sox5 in Sox10-defective fish partially rescued the formation of all pigment cells in zebrafish, and melanocytes and iridophores in medaka, suggesting that Sox5 represses Sox10-dependent formation of these pigment cells, similar to their interaction in mammalian melanocyte specification. In contrast, in medaka, loss of Sox10 acts cooperatively with Sox5, enhancing both xanthophore reduction and leucophore increase in sox5 mutants. Misexpression of Sox5 in the xanthophore/leucophore progenitors increased xanthophores and reduced leucophores in medaka. Thus, the mode of Sox5 function in xanthophore specification differs between medaka (promoting) and zebrafish (repressing), which is also the case in adult fish. Our findings reveal surprising diversity in even the mode of the interactions between Sox5 and Sox10 governing specification of pigment cell types in medaka and zebrafish, and suggest that this is related to the evolution of a fourth pigment  cell type.","fish","多能性前駆細胞から多様な細胞型を生成するメカニズムは、正常な発達の基本です。色素細胞は多能性神経堤細胞に由来し、硬骨魚類におけるそれらの多様性は、異なる細胞型の運命仕様を制御するメカニズムを研究するための優れたモデルを提供します。ゼブラフィッシュには3種類の色素細胞（メラノサイト、イリドフォア、キサントフォア）があり、メダカには4種類（ゼブラフィッシュと共有される3種類、およびロイコフォア）があり、これらの魚の各色素細胞タイプの運命指定のメカニズムがどのように保存されているかについて疑問が生じます。以前、Sry関連の転写因子Sox10がゼブラフィッシュの色素細胞の運命指定に重要であり、Sox5がメダカの共有キサントフォア/ロイコフォア前駆体のキサントフォアを促進し、ロイコフォアを抑制することを示しました。TILLING、TALEN、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、メダカとゼブラフィッシュのsox5とsox10の変異体を生成し、それらの複合変異体の表現型の比較分析を行いました。ロイコフォアを除くすべての色素細胞の仕様がSox10に依存していることを示します。Sox10欠損魚におけるSox5の喪失は、ゼブラフィッシュのすべての色素細胞、メダカのメラノサイトとイリドフォアの形成を部分的に救済し、哺乳類のメラノサイト仕様における相互作用と同様に、Sox5がこれらの色素細胞のSox10依存性形成を抑制することを示唆しています。対照的に、メダカでは、Sox10の喪失はSox5と協調して作用し、sox5変異体のキサントフォア減少とロイコフォア増加の両方を強化します。キサントフォア/ロイコフォア前駆細胞におけるSox5の誤発現は、メダカのキサントフォアを増加させ、ロイコフォアを減少させました。したがって、キサントフォア仕様のSox5機能のモードは、メダカ（促進）とゼブラフィッシュ（抑制）で異なります。これは成魚にも当てはまります。私たちの調査結果は、メダカとゼブラフィッシュの色素細胞型の仕様を支配するSox5とSox10の間の相互作用のモードでさえ驚くべき多様性を明らかにし、これが4番目の色素細胞型の進化に関連していることを示唆しています。"]
[89,30391422,"animal\n(fish)","paddlefish (Acipenseriformes)","CRISPR;Cas9;","GLP1R; GIPR","Peptides","Glucagon-related peptides from phylogenetically ancient fish reveal new approaches to the development of dual GCGR and GLP1R agonists for type 2 diabetes therapy.",2018,"110:19-29","[Graham GV et al.]","Ulster University, Coleraine, Northern Ireland, UK.",30391422,"10.1016/j.peptides.2018.10.013 ","The insulinotropic and antihyperglycaemic properties of glucagons from the sea lamprey (Petromyzontiformes), paddlefish (Acipenseriformes) and trout (Teleostei) and oxyntomodulin from dogfish (Elasmobranchii) and ratfish (Holocephali) were compared with those of human glucagon and GLP-1 in mammalian test systems. All fish peptides produced concentration-dependent stimulation of insulin release from BRIN-BD11 rat and 1.1 B4 human clonal beta-cells and isolated mouse islets.  Paddlefish glucagon was the most potent and effective peptide. The insulinotropic activity of paddlefish glucagon was significantly (P < 0.01) decreased after incubating BRIN-BD11 cells with the GLP1R antagonist, exendin-4(9-39) and the GCGR antagonist [des-His(1),Pro(4), Glu(9)] glucagon amide but GIPR antagonist, GIP(6-30)Cex-K(40)[palmitate] was without effect. Paddlefish and lamprey glucagons and dogfish oxyntomodulin (10 nmol L(-1)) produced significant (P < 0.01) increases in cAMP concentration in Chinese hamster lung (CHL) cells transfected with GLP1R and human embryonic kidney (HEK293) cells transfected with GCGR. The insulinotropic activity of paddlefish glucagon was attenuated in CRISPR/Cas9-engineered GLP1R knock-out INS-1 cells but not in GIPR knock-out cells. Intraperitoneal administration of all fish peptides, except ratfish oxyntomodulin, to mice together with a glucose load produced significant (P < 0.05) decreases in plasma glucose concentrations and paddlefish glucagon produced a greater release of insulin compared with GLP-1. Paddlefish glucagon shares the  sequences Glu(15)-Glu(16) and Glu(24)-Trp(25)-Leu(26)-Lys(27)-Asn(28)-Gly(29) with the potent GLP1R agonist, exendin-4 so may be regarded as a naturally occurring, dual-agonist hybrid peptide that may serve as a template design of new drugs for type 2 diabetes therapy.","fish","ウミヤツメ（Petromyzontiformes）、パドルフィッシュ（Acipenseriformes）、マス（Teleostei）のグルカゴン、およびドッグフィッシュ（Elasmobranchii）とラットフィッシュ（Holocephali）のオキシントモジュリンのインスリン分泌促進性と抗高血糖特性を、哺乳類のヒトグルカゴンとGLP-1の特性と比較しました。システム。すべての魚のペプチドは、BRIN-BD11ラットおよび1.1B4ヒトクローンベータ細胞および単離されたマウス膵島からのインスリン放出の濃度依存性刺激をもたらした。ヘラチョウザメのグルカゴンは最も強力で効果的なペプチドでした。ヘラチョウザメのグルカゴンのインスリン分泌活性は、BRIN-BD11細胞をGLP1R拮抗薬、エキセンディン-4（9-39）およびGCGR拮抗薬とインキュベートした後に有意に（P <0.01）減少しました[des-His（1）、Pro（4）、 Glu（9）]グルカゴンアミドだが、GIPR拮抗薬、GIP（6-30）Cex-K（40）[パルミテート]は効果がなかった。パドルフィッシュとランプレイグルカゴンおよびハナミズキのオキシントモジュリン（10 nmol L（-1））は、GLP1Rでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター肺（CHL）細胞とGCGRでトランスフェクトされたヒト胎児腎臓（HEK293）細胞でcAMP濃度の有意な（P <0.01）増加をもたらしました。ヘラチョウザメのグルカゴンのインスリン分泌活性は、CRISPR / Cas9で操作されたGLP1RノックアウトINS-1細胞では弱められましたが、GIPRノックアウト細胞では弱められませんでした。ラットフィッシュオキシントモジュリンを除くすべての魚ペプチドをグルコース負荷とともにマウスに腹腔内投与すると、血漿グルコース濃度が有意に（P <0.05）減少し、ヘラチョウザメのグルカゴンはGLP-1と比較してインスリンの放出が増加しました。パドルフィッシュグルカゴンは、Glu（15）-Glu（16）およびGlu（24）-Trp（25）-Leu（26）-Lys（27）-Asn（28）-Gly（29）のシーケンスを強力なGLP1Rアゴニストと共有します。エキセンディン-4は、2型糖尿病治療のための新薬のテンプレートデザインとして役立つ可能性のある、天然に存在するデュアルアゴニストハイブリッドペプチドと見なすことができます。"]
[90,30170168,"animal\n(fish)","pufferfish (Takifugu rubripes)","CRISPR;","pufferfish saxitoxin- and tetrodotoxin-binding protein 2","Toxicon","Genome editing of pufferfish saxitoxin- and tetrodotoxin-binding protein type 2 in Takifugu rubripes.",2018,"153:58-61","[Kato-Unoki Y et al.]","Kyushu University, Fukuoka, Japan.",30170168,"10.1016/j.toxicon.2018.08.001 ","The pufferfish saxitoxin- and tetrodotoxin-binding protein 2 (PSTBP2), which is involved in toxin accumulation, was knocked out in Takifugu rubripes embryos by using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 genome-editing technology. Treating the embryos with one of two single-guide RNA (sgRNA) resulted in mutation rates of 57.1% and 62.5%, respectively, as estimated using a heteroduplex mobility assay at 3 days postfertilization. Both sgRNAs might induced frameshift mutations that  knocked out the T. rubripes PSTBP2.","fish","毒素の蓄積に関与するフグのサキシトキシンおよびテトロドトキシン結合タンパク質2（PSTBP2）は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9ゲノム編集技術を使用してトラフグ胚でノックアウトされました。2つのシングルガイドRNA（sgRNA）の1つで胚を処理すると、受精後3日でヘテロ二本鎖移動度アッセイを使用して推定した場合、それぞれ57.1％と62.5％の突然変異率が得られました。両方のsgRNAは、T。rubripesPSTBP2をノックアウトするフレームシフト変異を誘発する可能性があります。"]
[91,30375441,"animal\n(fish)","rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)","CRISPR;Cas9;","insulin-like growth factor binding protein-2b","Scientific reports","Editing the duplicated insulin-like growth factor binding protein-2b gene in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).",2018,"8(1):16054","[Cleveland BM et al.]","Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Kearneysville, WV, USA.",30375441,"10.1038/s41598-018-34326-6 ","In salmonids, the majority of circulating insulin-like growth factor-I (IGF-I) is bound to IGF binding proteins (IGFBP), with IGFBP-2b being the most abundant in circulation. We used CRISPR/Cas9 methodology to disrupt expression of a functional IGFBP-2b protein by co-targeting for gene editing IGFBP-2b1 and IGFBP-2b2 subtypes, which represent salmonid-specific gene duplicates. Twenty-four rainbow trout were produced with mutations in the IGFBP-2b1 and IGFBP-2b2 genes. Mutant fish exhibited between 8-100% and 2-83% gene disruption for IGFBP-2b1 and IGFBP-2b2, respectively, with a positive correlation (P < 0.001) in gene mutation rate between individual fish. Analysis of IGFBP-2b protein indicated reductions in plasma IGFBP-2b abundance to between 0.04-0.96-fold of control levels. Plasma IGF-I, body weight, and fork length were reduced in mutants at 8 and 10 months post-hatch, which supports that IGFBP-2b is significant for carrying IGF-I. Despite reduced plasma IGF-I and IGFBP-2b in mutants, growth retardation in mutants was less severe between 10 and 12 months post-hatch (P < 0.05), suggesting a compensatory growth response occurred. These  findings indicate that gene editing using CRISPR/Cas9 and ligand blotting is a feasible approach for characterizing protein-level functions of duplicated IGFBP  genes in salmonids and is useful to unravel IGF-related endocrine mechanisms.","fish","サケ科魚類では、循環インスリン様成長因子-I（IGF-I）の大部分がIGF結合タンパク質（IGFBP）に結合しており、IGFBP-2bが循環系で最も豊富です。CRISPR / Cas9手法を使用して、サケ科魚類特異的遺伝子重複を表すIGFBP-2b1およびIGFBP-2b2サブタイプを遺伝子編集するためのコターゲティングにより、機能的なIGFBP-2bタンパク質の発現を破壊しました。IGFBP-2b1およびIGFBP-2b2遺伝子に変異がある24匹のニジマスが生産されました。変異魚は、IGFBP-2b1とIGFBP-2b2でそれぞれ8-100％から2-83％の遺伝子破壊を示し、個々の魚間の遺伝子変異率には正の相関（P <0.001）がありました。IGFBP-2bタンパク質の分析は、血漿IGFBP-2b存在量が対照レベルの0.04〜0.96倍に減少することを示しました。血漿IGF-I、体重、およびフォークの長さは、孵化後8か月および10か月の変異体で減少しました。これは、IGFBP-2bがIGF-Iの運搬に重要であることを裏付けています。変異体では血漿IGF-IとIGFBP-2bが減少したにもかかわらず、変異体の成長遅延は孵化後10〜12か月間はそれほど深刻ではなく（P <0.05）、代償性の成長反応が起こったことを示唆しています。これらの発見は、CRISPR / Cas9とリガンドブロッティングを使用した遺伝子編集が、サルモニドで複製されたIGFBP遺伝子のタンパク質レベルの機能を特徴づけるための実行可能なアプローチであり、IGF関連の内分泌メカニズムを解明するのに役立つことを示しています。"]
[92,30326628,"animal\n(fish)","rare minnow (Gobiocypris rarus)","CRISPR;Cas9;","integrin beta-1","International journal of molecular sciences","ITGB1b-Deficient Rare Minnows Delay Grass Carp Reovirus (GCRV) Entry and Attenuate GCRV-Triggered Apoptosis.",2018,"19(10)","[Chen G  et al.]","Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China.",30326628,"10.3390/ijms19103175 ","Integrin beta-1 (ITGB1) is a transmembrane protein belonging to the integrin family and it plays an important role in viral entry. In this study, the itgb1b gene of the rare minnow, Gobiocypris rarus, was cloned and analyzed. To investigate the possible role of itgb1b on grass carp reovirus (GCRV) infection,  we generated an ITGB1b-deficient rare minnow (ITGB1b(-/-)) using the CRISPR/Cas9  system. Following stimulation with GCRV, the survival time of the -ITGB1b(-/-) rare minnows was extended in comparison to the wild-type minnows. Moreover, the relative copy number of GCRV and the level of clathrin-mediated endocytosis-associated and apoptosis-related gene expression in the ITGB1b(-/-) rare minnows was significantly lower than that of the wild-type minnows. These results suggested that the absence of itgb1b reduced viral entry efficiency and the expression of apoptosis-related genes. Moreover, the data suggested that itgb1b played an important role in mediating the entry of viruses into the cells  via clathrin. Therefore, these findings provide novel insight into the function of itgb1b in the process of GCRV infection.","fish","インテグリンベータ-1（ITGB1）は、インテグリンファミリーに属する膜貫通タンパク質であり、ウイルスの侵入に重要な役割を果たします。この研究では、珍しいミノー、Gobiocypris rarusのitgb1b遺伝子がクローン化され、分析されました。ソウギョレオウイルス（GCRV）感染に対するitgb1bの可能な役割を調査するために、CRISPR / Cas9システムを使用してITGB1b欠損レアミノー（ITGB1b（-/-））を生成しました。GCRVによる刺激後、-ITGB1b（-/-）レアミノーの生存期間は、野生型ミノーと比較して延長されました。さらに、ITGB1b（-/-）レアミノーにおけるGCRVの相対コピー数とクラスリン媒介エンドサイトーシス関連およびアポトーシス関連遺伝子発現のレベルは、野生型ミノーよりも有意に低かった。これらの結果は、itgb1bの不在がウイルス侵入効率とアポトーシス関連遺伝子の発現を低下させることを示唆しました。さらに、データは、itgb1bがクラスリンを介した細胞へのウイルスの侵入を媒介する上で重要な役割を果たしたことを示唆しました。したがって、これらの調査結果は、GCRV感染の過程におけるitgb1bの機能に対する新たな洞察を提供します。"]
[93,29980564,"animal\n(fish)","sea lamprey","CRISPR;Cas9;","Semaphorin3F (Sema3F)","Development","An ancestral role for Semaphorin3F-Neuropilin signaling in patterning neural crest within the new vertebrate head.",2018,"145(14)","[York JR et al.]","University of Oklahoma, Norman, OK, USA.",29980564,"10.1242/dev.164780 ","The origin of the vertebrate head is one of the great unresolved issues in vertebrate evolutionary developmental biology. Although many of the novelties in  the vertebrate head and pharynx derive from the neural crest, it is still unknown how early vertebrates patterned the neural crest within the ancestral body plan they inherited from invertebrate chordates. Here, using a basal vertebrate, the sea lamprey, we show that homologs of Semaphorin3F (Sema3F) ligand and its Neuropilin (Nrp) receptors show complementary and dynamic patterns of expression  that correlate with key periods of neural crest development (migration and patterning of cranial neural crest-derived structures). Using CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, we demonstrate that lamprey Sema3F is essential for patterning of neural crest-derived melanocytes, cranial ganglia and the head  skeleton, but is not required for neural crest migration or patterning of trunk neural crest derivatives. Based on comparisons with jawed vertebrates, our results suggest that the deployment of Nrp-Sema3F signaling, along with other intercellular guidance cues, was pivotal in allowing early vertebrates to organize and pattern cranial neural crest cells into many of the hallmark structures that define the vertebrate head.","fish","脊椎動物の頭の起源は、脊椎動物の進化発生生物学における未解決の大きな問題の1つです。脊椎動物の頭と咽頭の目新しさの多くは神経の頂上に由来しますが、初期の脊椎動物が無脊椎動物の弦から受け継いだ祖先の体の計画の中で神経の頂上をどのようにパターン化したかはまだ不明です。ここでは、基礎脊椎動物である海ランプレイを使用して、セマホリン3F（Sema3F）リガンドとそのニューロピリン（Nrp）受容体のホモログが、神経紋の発達の重要な期間（頭蓋の移動とパターン化）と相関する相補的で動的な発現パターンを示すことを示します神経紋由来の構造）。CRISPR / Cas9を介した突然変異誘発を使用して、ヤツメウナギSema3Fが神経堤由来のメラノサイト、脳神経節、頭骨格のパターン形成に不可欠であるが、神経堤の移動や幹神経堤誘導体のパターン形成には必要ないことを示します。顎のある脊椎動物との比較に基づいて、我々の結果は、Nrp-Sema3Fシグナル伝達の展開が、他の細胞間ガイダンスキューとともに、初期の脊椎動物が頭蓋神経堤細胞を組織化し、脊椎動物を定義する多くの特徴的な構造にパターン化できるようにする上で極めて重要であったことを示唆しています。頭。"]
[94,29981309,"animal\n(fish)","sea lamprey","CRISPR;Cas9;","key genes required for the differentiation of oligodendrocytes in gnathostomes, including Nkx2.2, SoxE genes, and PDGFR","Developmental biology","Gliogenesis in lampreys shares gene regulatory interactions with oligodendrocyte  development in jawed vertebrates.",2018,"441(1):176-190","[Yuan T et al.]","University of Oklahoma, Norman, OK, USA.",29981309,"10.1016/j.ydbio.2018.07.002 ","Glial cells in the nervous system regulate and support many functions related to  neuronal activity. Understanding how the vertebrate nervous system has evolved demands a greater understanding of the mechanisms controlling evolution and development of glial cells in basal vertebrates. Among vertebrate glia, oligodendrocytes form an insulating myelin layer surrounding axons of the central nervous system (CNS) in jawed vertebrates. Jawless vertebrates lack myelinated axons but it is unclear when oligodendrocytes or the regulatory mechanisms controlling their development evolved. To begin to investigate the evolution of mechanisms controlling glial development, we identified key genes required for the differentiation of oligodendrocytes in gnathostomes, including Nkx2.2, SoxE genes, and PDGFR, analyzed their expression, and used CRISPR/Cas9 genome editing  to perturb their functions in a primitively jawless vertebrate, the sea lamprey.  We show in lamprey that orthologs required for oligodendrocyte development in jawed vertebrates are expressed in the lamprey ventral neural tube, in similar locations where gnathostome oligodendrocyte precursor cells (OPC) originate. In addition, they appear to be under the control of conserved mechanisms that regulate OPC development in jawed vertebrates and may also function in gliogenesis. Our results suggest that although oligodendrocytes first emerged in  jawed vertebrates, regulatory mechanisms required for their development predate the divergence of jawless and jawed vertebrates.","fish","神経系のグリア細胞は、神経活動に関連する多くの機能を調節およびサポートします。脊椎動物の神経系がどのように進化したかを理解するには、基底脊椎動物のグリア細胞の進化と発達を制御するメカニズムをより深く理解する必要があります。脊椎動物のグリアの中で、オリゴデンドロサイトは、顎のある脊椎動物の中枢神経系（CNS）の軸索を取り囲む絶縁性ミエリン層を形成します。無顎類の脊椎動物は有髄軸索を欠いているが、オリゴデンドロサイトまたはそれらの発達を制御する調節機構がいつ進化したかは不明である。グリアの発達を制御するメカニズムの進化の調査を開始するために、Nkx2.2、SoxE遺伝子、PDGFRなど、無顎類のオリゴデンドロサイトの分化に必要な重要な遺伝子を特定し、それらの発現を分析し、CRISPR / Cas9ゲノム編集を使用してそれらを混乱させました原始的に顎のない脊椎動物、ウミヤツメで機能します。顎口上綱オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）が発生する同様の場所で、顎のある脊椎動物のオリゴデンドロサイトの発達に必要なオルソログがヤツメウナギの腹側神経管で発現していることをヤツメウナギで示します。さらに、それらは顎のある脊椎動物のOPCの発達を調節する保存されたメカニズムの制御下にあるようであり、神経膠形成においても機能する可能性があります。我々の結果は、オリゴデンドロサイトが最初に顎のある脊椎動物に出現したが、それらの発達に必要な調節メカニズムは、無顎の脊椎動物と顎のある脊椎動物の分岐に先行することを示唆している。"]
[95,30144564,"animal\n(fish)","shrimp","CRISPR;Cas9;","EcgC1qR","Fish & shellfish immunology","Biological function of a gC1qR homolog (EcgC1qR) of Exopalaemon carinicauda in defending bacteria challenge.",2018,"82:378-385","[Zhang J et al.]","Hebei University, Baoding, Hebei, China.",30144564,"10.1016/j.fsi.2018.08.046 ","The gC1qR is a ubiquitously expressed cell protein that interacts with the globular heads of C1q (gC1q) and many other ligands. In this study, one gC1qR homolog gene was obtained from Exopalaemon carinicauda and named EcgC1qR. The complete nucleotide sequence of EcgC1qR contained a 774 bp open reading frame (ORF) encoding EcgC1qR precursor of 257amino acids. The deduced amino acid sequence of EcgC1qR revealed a 55-amino-acid-long mitochondrial targeting sequence at the N-terminal and a mitochondrial acidic matrix protein of 33kDa (MAM33) domain. The genomic organization of EcgC1qR gene showed that EcgC1qR gene contained five exons and four introns. EcgC1qR could express in all of the detected tissues and its expression was much higher in hepatopancreas and hemocytes. The expression of EcgC1qR in the hepatopancreas of prawns challenged with Vibrio parahaemolyticus and Aeromonas hydrophila changed in a time-dependent manner. The expression of EcgC1qR in prawns challenged with V. parahaemolyticus was up-regulated at 6h (p<0.05), and significantly up-regulated at 12h and 24h (p<0.01), and then returned to the control levels at 48h post-challenge (p>0.05). At the same time, the expression in Aeromonas-challenged group was significantly  up-regulated at 6, 12 and 24h. The recombinant EcgC1qR could inhibit the growth of two tested bacteria. In addition, we successfully deleted EcgC1qR gene through CRISPR/Cas9 technology and it was the first time to obtain the mutant of gC1qR homolog gene in crustacean. It's a great progress to study the biological function of gC1qR in crustacean in future.","fish","gC1qRは、C1q（gC1q）および他の多くのリガンドの球状頭部と相互作用する遍在的に発現する細胞タンパク質です。この研究では、1つのgC1qRホモログ遺伝子がExopalaemon carinicaudaから取得され、EcgC1qRと名付けられました。EcgC1qRの完全なヌクレオチド配列には、257アミノ酸のEcgC1qR前駆体をコードする774 bpのオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれていました。EcgC1qRの推定アミノ酸配列は、N末端に55アミノ酸長のミトコンドリアターゲティング配列と33kDa（MAM33）ドメインのミトコンドリア酸性マトリックスタンパク質を明らかにしました。EcgC1qR遺伝子のゲノム構成は、EcgC1qR遺伝子が5つのエキソンと4つのイントロンを含むことを示しました。EcgC1qRは、検出されたすべての組織で発現する可能性があり、その発現は肝膵臓および血球ではるかに高かった。腸炎ビブリオとアエロモナスハイドロフィラで攻撃されたエビの肝膵臓におけるEcgC1qRの発現は時間依存的に変化しました。腸炎ビブリオでチャレンジされたエビにおけるEcgC1qRの発現は、6時間でアップレギュレートされ（p <0.05）、12時間と24時間で有意にアップレギュレートされ（p <0.01）、チャレンジ後48時間でコントロールレベルに戻りました。 （p> 0.05）。同時に、アエロモナスに挑戦したグループの発現は、6、12、24時間で有意にアップレギュレートされました。組換えEcgC1qRは、2つのテストされた細菌の増殖を阻害する可能性があります。また、CRISPR / Cas9技術によりEcgC1qR遺伝子の削除に成功し、甲殻類でgC1qRホモログ遺伝子の変異体を取得するのは初めてでした。将来、甲殻類におけるgC1qRの生物学的機能を研究することは大きな進歩です。"]
[96,29621632,"animal\n(fish)","shrimp (ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda)","CRISPR;Cas9;","EcMIH","Fish & shellfish immunology","CRISPR/Cas9-mediated deletion of EcMIH shortens metamorphosis time from mysis larva to postlarva of Exopalaemon carinicauda.",2018,"77:244-251","[Zhang J et al.]","Hebei University, Baoding, Hebei, China. ",29621632,"10.1016/j.fsi.2018.04.002 ","The recently emerged CRISPR/Cas9 technology is the most flexible means to produce targeted mutations at the genomic loci in a variety of organisms. In Crustaceans, molt-inhibiting hormone (MIH) is an important negative-regulatory factor and plays a key role in suppressing the molting process. However, whether precise disruption of MIH in crustacean can be achieved and successfully used to improve  the development and growth has not been proved. In this research, the complementary DNA (cDNA) and genomic DNA, including flanking regions of the MIH gene (EcMIH) of ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda, were cloned and sequenced. Sequence analysis revealed that EcMIH was composed of three exons and  two introns. Analysis by RT-PCR showed that EcMIH mainly expressed in eyestalks.  During different development periods, EcMIH was highest in juvenile stage and extremely low in others but adult prawns eyestalks. In addition, we applied CRISPR/Cas9 technology to generate EcMIH knock-out (KO) prawns and then analyzed  the changes in their phenotypes. We efficiently generated 12 EcMIH-KO prawns out  of 250 injected one-cell stage embryos and the mutant rate reached 4.8% after embryo injection with one sgRNA targeting the second exon of EcMIH. The EcMIH-KO  prawns exhibited increased the body length and shortened the metamorphosis time of larvae from mysis larva to postlarva. Meanwhile, EcMIH-KO did not cause the health problems such as early stage death or deformity. In conclusion, we successfully obtained EcMIH gene and generated EcMIH-KO prawns using CRISPR/Cas9  technology. This study will certainly lead to a wide application prospect of MIH  gene in prawns breeding.","fish","最近登場したCRISPR / Cas9テクノロジーは、さまざまな生物のゲノム遺伝子座に標的変異を生成するための最も柔軟な手段です。甲殻類では、脱皮抑制ホルモン（MIH）が重要な負の調節因子であり、脱皮過程を抑制する上で重要な役割を果たしています。ただし、甲殻類のMIHの正確な破壊が達成され、開発と成長を改善するためにうまく使用できるかどうかは証明されていません。この研究では、リッジテールホワイトエビExopalaemon carinicaudaのMIH遺伝子（EcMIH）の隣接領域を含む相補的DNA（cDNA）とゲノムDNAがクローン化され、配列決定されました。シーケンス分析により、EcMIHは3つのエキソンと2つのイントロンで構成されていることが明らかになりました。RT-PCRによる分析は、EcMIHが主に眼柄で発現することを示した。さまざまな発達期間中、EcMIHは幼生期で最も高く、他の段階では非常に低かったが、成体のエビの眼柄であった。さらに、CRISPR / Cas9テクノロジーを適用してEcMIHノックアウト（KO）エビを生成し、それらの表現型の変化を分析しました。250個の注入された1細胞期胚から12個のEcMIH-KOエビを効率的に生成し、EcMIHの2番目のエキソンを標的とする1個のsgRNAを胚注入した後、変異率は4.8％に達しました。EcMIH-KOエビは体長の増加を示し、幼生のミシス幼生からポスト幼生への変身時間を短縮しました。一方、EcMIH-KOは早期死亡や奇形などの健康問題を引き起こしませんでした。結論として、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、EcMIH遺伝子の取得に成功し、EcMIH-KOエビを生成しました。この研究は確かにエビの繁殖におけるMIH遺伝子の幅広い応用の見通しにつながるでしょう。"]
[97,29044927,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","histamine receptor H3","Acta physiologica","Knockout of histamine receptor H3 alters adaptation to sudden darkness and monoamine levels in the zebrafish.",2018,"222(3)","[Puttonen HAJ et al.]","University of Helsinki, Helsinki,  Finland.",29044927,"10.1111/apha.12981 ","AIM: Histamine receptor H3 (HRH3) has substantial neuropharmacological potential. Currently, knockout models of this receptor have been investigated only in mice.  We characterized the expression of this receptor in the zebrafish and generated a zebrafish HRH3 knockout line. Using this model, we studied the role of HRH3 in important behaviours. We also analysed the effect of HRH3 knockout on monoaminergic systems, which has not been thoroughly studied in any animal model. METHODS: Generation of a mutant zebrafish line using the CRISPR-Cas9 system. Analysis of locomotor and social behaviour. Expression of HRH3 was characterized  using in situ hybridization. Analysis of monoamine networks using HPLC, immunohistochemistry and quantitative PCR. RESULTS: We found that HRH3 knockout zebrafish larvae showed a shorter period of increased locomotion after a sudden onset of darkness, while the knockout larvae had a wild-type-like acute response  to sudden darkness. Adult knockout fish showed decreased swimming velocity, although locomotor activity of knockout larvae was unaltered. Additionally, levels of dopamine and serotonin were significantly decreased in the knockout fish, while monoamine-related gene expression and immunohistochemistry patterns were unchanged. CONCLUSIONS: Our results show that HRH3 knockout larvae adapt faster to sudden darkness, suggesting a role for this receptor in regulating responses to changes in the environment. The decreased levels of dopamine and serotonin provide the first direct evidence that knockout of HRH3 alters these systems.","fish","目的：ヒスタミン受容体H3（HRH3）は、かなりの神経薬理学的可能性を持っています。現在、この受容体のノックアウトモデルはマウスでのみ調査されています。ゼブラフィッシュにおけるこの受容体の発現を特徴づけ、ゼブラフィッシュHRH3ノックアウトラインを生成しました。このモデルを使用して、重要な動作におけるHRH3の役割を研究しました。また、HRH3ノックアウトがモノアミン作動系に及ぼす影響を分析しましたが、これはどの動物モデルでも十分に研究されていません。方法：CRISPR-Cas9システムを使用した変異ゼブラフィッシュ系統の生成。自発運動および社会的行動の分析。HRH3の発現は、insituハイブリダイゼーションを使用して特徴づけられました。HPLC、免疫組織化学および定量PCRを使用したモノアミンネットワークの分析。結果：HRH3ノックアウトゼブラフィッシュの幼虫は突然の暗闇の開始後に運動の増加のより短い期間を示したが、ノックアウトの幼虫は突然の暗闇に対して野生型のような急性反応を示した。ノックアウト幼生の自発運動は変化しなかったが、成魚のノックアウト魚は遊泳速度の低下を示した。さらに、ドーパミンとセロトニンのレベルはノックアウト魚で有意に減少しましたが、モノアミン関連の遺伝子発現と免疫組織化学パターンは変化していませんでした。結論：私たちの結果は、HRH3ノックアウト幼虫が突然の暗闇に早く適応することを示しており、環境の変化に対する応答の調節におけるこの受容体の役割を示唆しています。ドーパミンとセロトニンのレベルの低下は、HRH3のノックアウトがこれらのシステムを変更するという最初の直接的な証拠を提供します。"]
[98,29727687,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","exosc9","American journal of human genetics","Variants in EXOSC9 Disrupt the RNA Exosome and Result in Cerebellar Atrophy with  Spinal Motor Neuronopathy.",2018,"102(5):858-873","[Burns DT et al.]","Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK.",29727687,"10.1016/j.ajhg.2018.03.011 ","The exosome is a conserved multi-protein complex that is essential for correct RNA processing. Recessive variants in exosome components EXOSC3, EXOSC8, and RBM7 cause various constellations of pontocerebellar hypoplasia (PCH), spinal muscular atrophy (SMA), and central nervous system demyelination. Here, we report on four  unrelated affected individuals with recessive variants in EXOSC9 and the effect of the variants on the function of the RNA exosome in vitro in affected individuals' fibroblasts and skeletal muscle and in vivo in zebrafish. The clinical presentation was severe, early-onset, progressive SMA-like motor neuronopathy, cerebellar atrophy, and in one affected individual, congenital fractures of the long bones. Three affected individuals of different ethnicity carried the homozygous c.41T>C (p.Leu14Pro) variant, whereas one affected individual was compound heterozygous for c.41T>C (p.Leu14Pro) and c.481C>T (p.Arg161( *)). We detected reduced EXOSC9 in fibroblasts and skeletal muscle and observed a reduction of the whole multi-subunit exosome complex on blue-native polyacrylamide gel electrophoresis. RNA sequencing of fibroblasts and skeletal muscle detected significant >2-fold changes in genes involved in neuronal development and cerebellar and motor neuron degeneration, demonstrating the widespread effect of the variants. Morpholino oligonucleotide knockdown and CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of exosc9 in zebrafish recapitulated aspects of  the human phenotype, as they have in other zebrafish models of exosomal disease.  Specifically, portions of the cerebellum and hindbrain were absent, and motor neurons failed to develop and migrate properly. In summary, we show that variants in EXOSC9 result in a neurological syndrome combining cerebellar atrophy and spinal motoneuronopathy, thus expanding the list of human exosomopathies.","fish","エクソソームは、正しいRNAプロセッシングに不可欠な保存された多タンパク質複合体です。エクソソームコンポーネントEXOSC3、EXOSC8、およびRBM7の劣性変異は、橋小脳形成不全（PCH）、脊髄性筋萎縮症（SMA）、および中枢神経系脱髄のさまざまな星座を引き起こします。ここでは、EXOSC9の劣性変異体を持つ4つの無関係な影響を受けた個人と、影響を受けた個人の線維芽細胞と骨格筋のinvitroおよびゼブラフィッシュのinvivoでのRNAエクソソームの機能に対する変異体の影響について報告します。臨床症状は、重度の早期発症の進行性SMA様運動神経障害、小脳萎縮、および影響を受けた1人の個人では、長骨の先天性骨折でした。異なる民族の3人の罹患者はホモ接合c.41T> C（p.Leu14Pro）変異体を持っていたが、1人の罹患者はc.41T> C（p.Leu14Pro）およびc.481C> T（p.Arg161（p.Arg161（p.Arg161（ *））。線維芽細胞と骨格筋でEXOSC9の減少を検出し、ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動でマルチサブユニットエキソソーム複合体全体の減少を観察しました。線維芽細胞と骨格筋のRNAシーケンスにより、ニューロンの発達と小脳および運動ニューロンの変性に関与する遺伝子の2倍を超える有意な変化が検出され、変異体の広範な効果が実証されました。ゼブラフィッシュにおけるモルフォリノオリゴヌクレオチドノックダウンおよびCRISPR / Cas9を介したexosc9の突然変異誘発は、他のゼブラフィッシュのエクソソーム疾患モデルと同様に、ヒトの表現型の側面を再現しました。具体的には、小脳と後脳の一部が存在せず、運動ニューロンが発達して適切に移動することができませんでした。要約すると、EXOSC9の変異体は、小脳萎縮と脊髄運動神経障害を組み合わせた神経学的症候群を引き起こし、ヒトの外交症のリストを拡大することを示しています。"]
[99,29724820,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR ;","tyrosine kinase containing immunoglobulin and epidermal growth factor homology 1 antisense","Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology","Temporal and Spatial Post-Transcriptional Regulation of Zebrafish tie1 mRNA by Long Noncoding RNA During Brain Vascular Assembly.",2018,"38(7):1562-1575","[Chowdhury TA et al.]","Massachusetts General Hospital, Charlestown. MA, USA.",29724820,"10.1161/ATVBAHA.118.310848 ","OBJECTIVE: Tie1 (tyrosine kinase containing immunoglobulin and epidermal growth factor homology 1), an endothelial and hematopoietic cell-specific receptor tyrosine kinase, is an important regulator of angiogenesis and critical for maintaining vascular integrity. The post-transcriptional regulation of tie1 mRNA  expression is not understood, but it might partly explain Tie1's differential expression pattern in endothelium. Following up on our previous work that identified natural antisense transcripts from the tie1 locus-tie1 antisense (tie1AS), which regulates tie1 mRNA levels in zebrafish-we attempted to identify  the mechanism of this regulation. APPROACH AND RESULTS: Through in vitro and in vivo ribonucleoprotein binding studies, we demonstrated that tie1AS long noncoding RNA interacts with an RNA binding protein-embryonic lethal and abnormal vision Drosophila-like 1 (Elavl1)-that regulates tie1 mRNA levels. When we disrupted the interaction between tie1AS and Elavl1 by using constitutively active antisense morpholino oligonucleotides or photoactivatable morpholino oligonucleotides, tie1 mRNA levels increased between 26 and 31 hours post-fertilization, particularly in the head. This increase correlated with dilation of primordial midbrain channels, smaller eyes, and reduced ventricular space. We also observed these phenotypes when we used CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-mediated CRISPRi (CRISPR-mediated interference) to knock down tie1AS. Treatment of the morpholino oligonucleotide-injected embryos with a small molecule that decreased tie1 mRNA levels rescued all 3 abnormal phenotypes. CONCLUSIONS: We identified a novel mode of temporal and spatial post-transcriptional regulation of tie1 mRNA. It involves long noncoding RNA, tie1AS, and Elavl1 (an interactor of tie1AS).","fish","目的：内皮および造血細胞特異的受容体型チロシンキナーゼであるTie1（免疫グロブリンおよび上皮成長因子相同性1を含むチロシンキナーゼ）は、血管新生の重要な調節因子であり、血管の完全性を維持するために重要です。tie1 mRNA発現の転写後の調節は理解されていませんが、内皮におけるTie1の差次的発現パターンを部分的に説明している可能性があります。ゼブラフィッシュのtie1mRNAレベルを調節するtie1遺伝子座（tie1アンチセンス（tie1AS））から天然のアンチセンス転写物を同定した以前の研究に続いて、この調節のメカニズムを同定しようとしました。アプローチと結果：invitroおよびinvivoのリボヌクレオタンパク質結合研究を通じて、tie1ASの長鎖ノンコーディングRNAがRNA結合タンパク質（胚致死および異常視力のショウジョウバエ様1（Elavl1））と相互作用し、tie1mRNAレベルを調節することを示しました。構成的に活性なアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドまたは光活性化可能なモルホリノオリゴヌクレオチドを使用してtie1ASとElavl1の間の相互作用を破壊した場合、tie1 mRNAレベルは受精後26〜31時間、特に頭部で増加しました。この増加は、原始中脳チャネルの拡張、より小さな目、および脳室スペースの減少と相関していました。また、CRISPR（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）を介したCRISPRi（CRISPRを介した干渉）を使用してtie1ASをノックダウンしたときに、これらの表現型を観察しました。モルホリノオリゴヌクレオチドを注入した胚を、tie1 mRNAレベルを低下させる小分子で処理すると、3つの異常な表現型すべてが救済されました。結論：tie1mRNAの時間的および空間的な転写後調節の新しいモードを識別しました。これには、長鎖ノンコーディングRNA、tie1AS、およびElavl1（tie1ASのインタラクター）が含まれます。"]
[100,30262142,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","leucyl-tRNA synthetase (larsb)","Biochemical and biophysical research communications","Loss of Leucyl-tRNA synthetase b leads to ILFS1-like symptoms in zebrafish.",2018,"505(2):378-384","[Wang Z et al.]","Southwest University, Beibei, Chongqing, China.",30262142,"10.1016/j.bbrc.2018.09.133 ","Leucyl-tRNA synthetase (LARS) is a kind of aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs), which is important for protein synthesis. Following the discovery of three clinical cases which carry LARS mutations, it has been designated as the infantile liver failure syndrome type 1 (ILFS1) gene. ILFS1 is a kind of infantile hepatopathy, which is difficult to diagnose and manage. As the mechanism underlying this disease is poorly understood and LARS is conserved among vertebrates, we obtained zebrafish larsb(cq68) mutant via CRISPR/Cas9 technology to investigate the role of larsb in vivo. In mutant, the proliferation ability of liver was drastically decreased at later stages accompanied with severe DNA damage. Further studies demonstrated that the mTORC1 signaling was hyperactivated in larsb(cq68) mutant. Inhibition of mTORC1 signaling pathway by Rapamycin or mTORC1 morpholino can partially rescue the liver failure of the mutants. These data revealed that larsb mutation caused ILFS1-like phenotype in zebrafish, and indicated this mutant may serve as a potential model for ILFS1. Furthermore, we demonstrated that rapamycin treatment can partially rescue the liver defect in mutants, thus providing a practicable therapeutic plan for ILFS1.","fish","ロイシルtRNAシンテターゼ（LARS）は、アミノアシルtRNAシンテターゼ（aaRS）の一種であり、タンパク質合成に重要です。LARS変異を有する3つの臨床例の発見に続いて、それは乳児肝不全症候群1型（ILFS1）遺伝子として指定されました。ILFS1は一種の乳児肝障害であり、診断と管理が困難です。この病気の根底にあるメカニズムはよくわかっておらず、LARSは脊椎動物間で保存されているため、CRISPR / Cas9テクノロジーを介してゼブラフィッシュlarsb（cq68）変異体を取得し、invivoでのlarsbの役割を調査しました。突然変異体では、肝臓の増殖能力は、深刻なDNA損傷を伴う後の段階で劇的に低下しました。さらなる研究は、mTORC1シグナル伝達がlarsb（cq68）変異体で過剰活性化されたことを示しました。ラパマイシンまたはmTORC1モルホリノによるmTORC1シグナル伝達経路の阻害は、変異体の肝不全を部分的に救うことができます。これらのデータは、larsb変異がゼブラフィッシュでILFS1のような表現型を引き起こしたことを明らかにし、この変異体がILFS1の潜在的なモデルとして役立つ可能性があることを示しました。さらに、ラパマイシン治療が変異体の肝臓欠損を部分的に救済できることを実証し、ILFS1の実用的な治療計画を提供します。"]
[101,29772239,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","ras related","Biochemical and biophysical research communications","Small GTPase R-Ras participates in neural tube formation in zebrafish embryonic spinal cord.",2018,"501(3):786-790","[Ohata S et al.]","Musashino University, Tokyo, Japan.",29772239,"10.1016/j.bbrc.2018.05.074 ","Ras related (R-Ras), a small GTPase, is involved in the maintenance of apico-basal polarity in neuroepithelial cells of the zebrafish hindbrain, axonal  collapse in cultured murine hippocampal neurons, and maturation of blood vessels  in adult mice. However, the role of R-Ras in neural tube formation remains unknown. Using antisense morpholino oligonucleotides (AMOs), we found that in the spinal cord of zebrafish embryos, the lumen was formed bilaterally in rras morphants, whereas it was formed at the midline in control embryos. As AMO can cause off-target effects, we generated rras mutant zebrafish lines using CRISPR/Cas9 technology. Although these rras mutant embryos did not have a bilateral lumen in the spinal cord, the following findings suggest that the phenotype is unlikely due to an off-target effect of rras AMO: 1) The rras morphant phenotype was rescued by an injection of AMO-resistant rras mRNA, and 2) a bilaterally segregated spinal cord was not observed in rras mutant embryos injected with rras AMO. The results suggest that the function of other ras family genes may be redundant in rras mutants. Previous research reported a bilaterally  formed lumen in the spinal cord of zebrafish embryos with a mutation in a planar  cell polarity (PCP) gene, van gogh-like 2 (vangl2). In the present study, in cultured cells, R-Ras was co-immunoprecipitated with Vangl2 but not with another  PCP regulator, Pricke1. Interestingly, the interaction between R-Ras and Vangl2 was stronger in guanine-nucleotide free point mutants of R-Ras than in wild-type  or constitutively active (GTP-bound) forms of R-Ras. R-Ras may regulate neural tube formation in cooperation with Vangl2 in the developing zebrafish spinal cord.","fish","小さなGTPaseであるRas関連（R-Ras）は、ゼブラフィッシュ後脳の神経上皮細胞の頂端基底極性の維持、培養マウス海馬ニューロンの軸索崩壊、および成体マウスの血管の成熟に関与しています。ただし、神経管形成におけるR-Rasの役割は不明であります。アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（AMO）を使用して、ゼブラフィッシュ胚の脊髄では、内腔がrrasモルファントでは両側に形成されたのに対し、対照胚では正中線で形成されたことがわかりました。AMOはオフターゲット効果を引き起こす可能性があるため、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してrras変異ゼブラフィッシュ系統を生成しました。これらのrras変異体胚は脊髄に両側の内腔を持っていませんでしたが、次の調査結果は、表現型がrras AMOのオフターゲット効果のためにありそうもないことを示唆しています：1）rrasmorphant表現型はAMOの注射によって救出されました-耐性rrasmRNA、および2）rras AMOを注入したrras変異体胚では、両側に分離した脊髄は観察されませんでした。結果は、他のrasファミリー遺伝子の機能がrras変異体では冗長である可能性があることを示唆しています。以前の研究では、ゼブラフィッシュ胚の脊髄に両側に形成された内腔が報告されており、平面細胞極性（PCP）遺伝子であるゴッホ様2（vangl2）に変異があります。本研究では、培養細胞において、R-RasはVangl2と共免疫沈降しましたが、別のPCPレギュレーターであるPricke1とは共免疫沈降しませんでした。興味深いことに、R-RasとVangl2の間の相互作用は、R-Rasのグアニンヌクレオチドフリーポイント変異体の方が、野生型または構成的に活性な（GTP結合）形態のR-Rasよりも強かった。R-Rasは、発達中のゼブラフィッシュ脊髄におけるVangl2と協力して神経管形成を調節する可能性があります。"]
[102,29331378,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","SET- and MYND domain containing protein 1 (smyd1a)","Biochemical and biophysical research communications","Loss of zebrafish Smyd1a interferes with myofibrillar integrity without triggering the misfolded myosin response.",2018,"496(2):339-345","[Paone C et al.]","University of Ulm, Ulm, Germany.",29331378,"10.1016/j.bbrc.2018.01.060 ","Sarcomeric protein turnover needs to be tightly balanced to assure proper assembly and renewal of sarcomeric units within muscle tissues. The mechanisms regulating these fundamental processes are only poorly understood, but of great clinical importance since many cardiac and skeletal muscle diseases are associated with defective sarcomeric organization. The SET- and MYND domain containing protein 1b (Smyd1b) is known to play a crucial role in myofibrillogenesis by functionally interacting with the myosin chaperones Unc45b  and Hsp90alpha1. In zebrafish, Smyd1b, Unc45b and Hsp90alpha1 are part of the misfolded myosin response (MMR), a regulatory transcriptional response that is activated by disturbed myosin homeostasis. Genome duplication in zebrafish led to a second smyd1 gene, termed smyd1a. Morpholino- and CRISPR/Cas9-mediated knockdown of smyd1a led to significant perturbations in sarcomere structure resulting in decreased cardiac as well as skeletal muscle function. Similar to Smyd1b, we found Smyd1a to localize to the sarcomeric M-band in skeletal and cardiac muscles. Overexpression of smyd1a efficiently compensated for the loss of Smyd1b in flatline (fla) mutant zebrafish embryos, rescued the myopathic phenotype and suppressed the MMR in Smyd1b-deficient embryos, suggesting overlapping functions of both Smyd1 paralogs. Interestingly, Smyd1a is not transcriptionally activated in Smyd1b-deficient fla mutants, demonstrating lack of genetic compensation despite the functional redundancy of both zebrafish Smyd1 paralogs.","fish","筋肉組織内のサルコメアユニットの適切な組み立てと更新を確実にするために、サルコメアタンパク質の代謝回転はしっかりとバランスをとる必要があります。これらの基本的なプロセスを調節するメカニズムはよくわかっていませんが、多くの心臓および骨格の筋肉疾患が欠陥のある肉腫組織に関連しているため、臨床的に非常に重要です。タンパク質1b（Smyd1b）を含むSETドメインおよびMYNDドメインは、ミオシンシャペロンUnc45bおよびHsp90alpha1と機能的に相互作用することにより、筋原線維形成において重要な役割を果たすことが知られています。ゼブラフィッシュでは、Smyd1b、Unc45b、およびHsp90alpha1は、ミオシンの恒常性の乱れによって活性化される調節転写応答である、誤って折りたたまれたミオシン応答（MMR）の一部です。ゼブラフィッシュのゲノム重複は、smyd1aと呼ばれる2番目のsmyd1遺伝子につながりました。モルフォリノおよびCRISPR / Cas9を介したsmyd1aのノックダウンは、サルコメア構造に重大な摂動をもたらし、心臓および骨格筋の機能を低下させました。Smyd1bと同様に、Smyd1aが骨格筋と心筋のサルコメアMバンドに局在することを発見しました。smyd1aの過剰発現は、フラットライン（fla）変異ゼブラフィッシュ胚におけるSmyd1bの喪失を効率的に補償し、ミオパチー表現型を救出し、Smyd1b欠損胚におけるMMRを抑制し、両方のSmyd1パラログの機能の重複を示唆しています。興味深いことに、Smyd1aはSmyd1b欠損fla変異体では転写的に活性化されておらず、両方のゼブラフィッシュSmyd1パラログの機能的冗長性にもかかわらず遺伝的補償の欠如を示しています。"]
[103,29897878,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","Niemann-Pick type C1","Biological chemistry","Model construction of Niemann-Pick type C disease in zebrafish.",2018,"399(8):903-910","[Lin Y et al.]","Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China.",29897878,"10.1515/hsz-2018-0118 ","Niemann-Pick type C disease (NPC) is a rare human disease, with limited effective treatment options. Most cases of NPC disease are associated with inactivating mutations of the NPC1 gene. However, cellular and molecular mechanisms responsible for the NPC1 pathogenesis remain poorly defined. This is partly due to the lack of a suitable animal model to monitor the disease progression. In this study, we used CRISPR to construct an NPC1-/- zebrafish model, which faithfully reproduced the cardinal pathological features of this disease. In contrast to the wild type (WT), the deletion of NPC1 alone caused significant hepatosplenomegaly, ataxia, Purkinje cell death, increased lipid storage, infertility and reduced body length and life span. Most of the NPC1-/- zebrafish  died within the first month post fertilization, while the remaining specimens developed slower than the WT and died before reaching 8 months of age. Filipin-stained hepatocytes of the NPC1-/- zebrafish were clear, indicating abnormal accumulation of unesterified cholesterol. Lipid profiling showed a significant difference between NPC1-/- and WT zebrafish. An obvious accumulation  of seven sphingolipids was detected in livers of NPC1-/- zebrafish. In summary, our results provide a valuable model system that could identify promising therapeutic targets and treatments for the NPC disease.","fish","ニーマンピックC型疾患（NPC）はまれなヒトの疾患であり、効果的な治療法の選択肢は限られています。NPC病のほとんどの症例は、NPC1遺伝子の不活性化変異に関連しています。ただし、NPC1病因の原因となる細胞および分子メカニズムは十分に定義されていないままです。これは、病気の進行を監視するのに適した動物モデルが不足していることが一因です。この研究では、CRISPRを使用してNPC1-/-ゼブラフィッシュモデルを構築しました。このモデルは、この疾患の主要な病理学的特徴を忠実に再現しました。野生型（WT）とは対照的に、NPC1のみを削除すると、重大な肝脾腫、運動失調、プルキンエ細胞死、脂質貯蔵の増加、不妊症、体長と寿命の短縮が引き起こされました。NPC1-/-ゼブラフィッシュのほとんどは、受精後1か月以内に死亡しましたが、残りの標本はWTよりも発達が遅く、8か月齢に達する前に死亡しました。NPC1-/-ゼブラフィッシュのフィリピンで染色された肝細胞は透明であり、エステル化されていないコレステロールの異常な蓄積を示しています。脂質プロファイリングは、NPC1-/-とWTゼブラフィッシュの間に有意差を示しました。NPC1-/-ゼブラフィッシュの肝臓で7つのスフィンゴ脂質の明らかな蓄積が検出されました。要約すると、私たちの結果は、NPC病の有望な治療標的と治療法を特定できる貴重なモデルシステムを提供します。"]
[104,30244429,"animal\n(fish)","zebrafish","Cas9;","ERV","Biotechnology letters","Generation of Cas9 transgenic zebrafish and their application in establishing an  ERV-deficient animal model.",2018,"40(11-12):1507-1518","[Yang Z  et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu, China.",30244429,"10.1007/s10529-018-2605-5 ","OBJECTIVES: To investigate the effect of endogenous Cas9 on genome editing efficiency in transgenic zebrafish. RESULTS: Here we have constructed a transgenic zebrafish strain that can be screened by pigment deficiency. Compared  with the traditional CRISPR injection method, the transgenic zebrafish can improve the efficiency of genome editing significantly. At the same time, we first observed that the phenotype of vertebral malformation in early embryonic development of zebrafish after ZFERV knockout. CONCLUSIONS: The transgenic zebrafish with expressed Cas9, is more efficient in genome editing. And the results of ZFERV knockout indicated that ERV may affect the vertebral development by Notch1/Delta D signal pathway.","fish","目的：トランスジェニックゼブラフィッシュのゲノム編集効率に対する内因性Cas9の影響を調査すること。結果：ここでは、色素欠乏によってスクリーニングできるトランスジェニックゼブラフィッシュ株を構築しました。従来のCRISPR注入法と比較して、トランスジェニックゼブラフィッシュはゲノム編集の効率を大幅に向上させることができます。同時に、ZFERVノックアウト後のゼブラフィッシュの初期胚発生における脊椎奇形の表現型を最初に観察しました。結論：Cas9を発現したトランスジェニックゼブラフィッシュは、ゲノム編集においてより効率的です。そして、ZFERVノックアウトの結果は、ERVがNotch1 / DeltaDシグナル経路による椎骨の発達に影響を与える可能性があることを示しました。"]
[105,29544468,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","dual-specificity phosphatase (Dusp) family (dusp6, dusp2)","BMC developmental biology","A parental requirement for dual-specificity phosphatase 6 in zebrafish.",2018,"18(1):6","[Maurer JM et al.]","University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, USA.",29544468,"10.1186/s12861-018-0164-6 ","BACKGROUND: Signaling cascades, such as the extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway, play vital roles in early vertebrate development. Signals through  these pathways are initiated by a growth factor or hormone, are transduced through a kinase cascade, and result in the expression of specific downstream genes that promote cellular proliferation, growth, or differentiation. Tight regulation of these signals is provided by positive or negative modulators at varying levels in the pathway, and is required for proper development and function. Two members of the dual-specificity phosphatase (Dusp) family, dusp6 and dusp2, are believed to be negative regulators of the ERK pathway and are expressed in both embryonic and adult zebrafish, but their specific roles in embryogenesis remain to be fully understood. RESULTS: Using CRISPR/Cas9 genome editing technology, we generated zebrafish lines harboring germ line deletions in dusp6 and dusp2. We do not detect any overt defects in dusp2 mutants, but we find that approximately 50% of offspring from homozygous dusp6 mutants do not proceed  through embryonic development. These embryos are fertilized, but are unable to proceed past the first zygotic mitosis and stall at the 1-cell stage for several  hours before dying by 10 h post fertilization. We demonstrate that dusp6 is expressed in gonads of both male and female zebrafish, suggesting that loss of dusp6 causes defects in germ cell production. Notably, the 50% of homozygous dusp6 mutants that complete the first cell division appear to progress through embryogenesis normally and give rise to fertile adults. CONCLUSIONS: The fact that offspring of homozygous dusp6 mutants stall prior to activation of the zygotic genome, suggests that loss of dusp6 affects gametogenesis and/or parentally-directed early development. Further, since only approximately 50% of homozygous dusp6 mutants are affected, we postulate that ERK signaling is tightly regulated and that dusp6 is required to keep ERK signaling within a range that is permissive for proper embryogenesis. Lastly, since dusp6 is expressed throughout  zebrafish embryogenesis, but dusp6 mutants do not exhibit defects after the first cell division, it is possible that other regulators of the ERK pathway compensate for loss of dusp6 at later stages.","fish","背景：細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）経路などのシグナル伝達カスケードは、初期の脊椎動物の発育において重要な役割を果たします。これらの経路を介したシグナルは、成長因子またはホルモンによって開始され、キナーゼカスケードを介して伝達され、細胞の増殖、成長、または分化を促進する特定の下流遺伝子の発現をもたらします。これらのシグナルの厳密な調節は、経路のさまざまなレベルで正または負のモジュレーターによって提供され、適切な発達と機能に必要です。二重特異性ホスファターゼ（Dusp）ファミリーの2つのメンバー、dusp6とdusp2は、ERK経路の負の調節因子であると考えられており、胚と成体のゼブラフィッシュの両方で発現しますが、胚発生におけるそれらの特定の役割は完全に理解されていません。結果：CRISPR / Cas9ゲノム編集技術を使用して、dusp6とdusp2の生殖細胞系列の欠失を含むゼブラフィッシュ系統を生成しました。dusp2変異体には明らかな欠陥は検出されませんが、ホモ接合型dusp6変異体の子孫の約50％が胚発生を進行しないことがわかります。これらの胚は受精しますが、最初の接合性有糸分裂を超えて進行することができず、受精後10時間までに死ぬ前に1細胞期で数時間失速します。dusp6がオスとメスの両方のゼブラフィッシュの性腺で発現していることを示し、dusp6の喪失が生殖細胞産生の欠陥を引き起こすことを示唆しています。特に、最初の細胞分裂を完了するホモ接合型dusp6変異体の50％は、正常に胚発生を進行し、繁殖力のある成虫を生み出すようです。結論：ホモ接合性dusp6変異体の子孫が接合性ゲノムの活性化の前に失速するという事実は、dusp6の喪失が配偶子形成および/または親に向けられた初期の発達に影響を与えることを示唆している。さらに、ホモ接合型dusp6変異体の約50％のみが影響を受けるため、ERKシグナル伝達は厳密に制御されており、適切な胚発生を許容する範囲内にERKシグナル伝達を維持するにはdusp6が必要であると仮定します。最後に、dusp6はゼブラフィッシュの胚発生全体で発現しますが、dusp6変異体は最初の細胞分裂後に欠陥を示さないため、ERK経路の他の調節因子が後の段階でdusp6の喪失を補う可能性があります。"]
[106,29435650,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","CreER(T2) (inserted);at otx2 locus","Cell and tissue research","Targeted knock-in of CreER (T2) in zebrafish using CRISPR/Cas9.",2018,"372(1):41-50","[Kesavan G  et al.]","Technische Universitat Dresden, Dresden, Germany.",29435650,"10.1007/s00441-018-2798-x ","New genome-editing approaches, such as the CRISPR/Cas system, have opened up great opportunities to insert or delete genes at targeted loci and have revolutionized genetics in model organisms like the zebrafish. The Cre-loxp recombination system is widely used to activate or inactivate genes with high spatial and temporal specificity. Using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in strategy, we inserted a zebrafish codon-optimized CreER (T2) transgene at the otx2 gene locus to generate a conditional Cre-driver line. We chose otx2 as it is a patterning gene of the anterior neural plate that is expressed during early development. By knocking in CreER (T2) upstream of the endogenous ATG of otx2, we utilized this gene's native promoter and enhancer elements to perfectly match CreER (T2) and endogenous otx2 expression patterns. Next, by combining this novel driver line with a Cre-dependent reporter line, we show that only in the presence of tamoxifen can efficient Cre-loxp-mediated recombination be achieved in the anterior neural plate-derived tissues like the telencephalon, the eye and the optic tectum. Our results imply that the otx2:CreER (T2) transgenic fish will be  a valuable tool for lineage tracing and conditional mutant studies in larval and  adult zebrafish.","fish","CRISPR / Casシステムなどの新しいゲノム編集アプローチは、標的遺伝子座に遺伝子を挿入または削除する絶好の機会を開き、ゼブラフィッシュなどのモデル生物の遺伝学に革命をもたらしました。Cre-loxp組換えシステムは、高い空間的および時間的特異性を持つ遺伝子を活性化または不活性化するために広く使用されています。CRISPR / Cas9を介したノックイン戦略を使用して、ゼブラフィッシュのコドン最適化CreER（T2）導入遺伝子をotx2遺伝子座に挿入し、条件付きCreドライバーラインを生成しました。otx2は、発達初期に発現する前神経板のパターン形成遺伝子であるため、選択しました。otx2の内因性ATGの上流にあるCreER（T2）をノックインすることにより、この遺伝子のネイティブプロモーターおよびエンハンサー要素を利用して、CreER（T2）および内因性otx2の発現パターンを完全に一致させました。次に、この新しいドライバーラインをCre依存レポーターラインと組み合わせることにより、タモキシフェンの存在下でのみ、終脳、眼、および前神経板由来組織で効率的なCre-loxpを介した組換えを達成できることを示します。視蓋。私たちの結果は、otx2：CreER（T2）トランスジェニック魚が、幼生および成体のゼブラフィッシュにおける系統追跡および条件付き変異研究のための貴重なツールになることを示唆しています。"]
[107,30566854,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","heat shock factor 5","Cell reports","Heat Shock Factor 5 Is Essential for Spermatogenesis in Zebrafish.",2018,"25(12):3252-3261.e4","[Saju JM et al.]","Temasek Life Sciences Laboratory, Singapore, Singapore.",30566854,"10.1016/j.celrep.2018.11.090 ","Heat shock factors (Hsfs) are transcription factors that regulate responses to heat shock and other environmental stimuli. Four heat shock factors (Hsf1-4) have been characterized from vertebrates to date. In addition to stress response, they also play important roles in development and gametogenesis. Here, we study the fifth member of heat shock factor family, Hsf5, using zebrafish as a model organism. Mutant hsf5(-/-) males, generated by CRISPR/Cas9 technique, were infertile with drastically reduced sperm count, increased sperm head size, and abnormal tail architecture, whereas females remained fertile. We show that Hsf5 is required for progression through meiotic prophase 1 during spermatogenesis as  suggested by the accumulation of cells in the leptotene and zygotene-pachytene stages and increased apoptosis in post-meiotic cells. hsf5(-/-) mutants show gonadal misregulation of a substantial number of genes with roles in cell cycle,  apoptosis, protein modifications, and signal transduction, indicating an important role of Hsf5 in early stages of spermatogenesis.","fish","熱ショック因子（Hsfs）は、熱ショックやその他の環境刺激に対する応答を調節する転写因子です。現在まで、脊椎動物から4つの熱ショック因子（Hsf1-4）が特徴づけられています。ストレス反応に加えて、それらは発達と配偶子形成においても重要な役割を果たします。ここでは、ゼブラフィッシュをモデル生物として使用して、熱ショック因子ファミリーの5番目のメンバーであるHsf5を研究します。CRISPR / Cas9技術によって生成された変異型hsf5（-/-）のオスは不妊であり、精子数が大幅に減少し、精子の頭のサイズが大きくなり、尾の構造が異常でしたが、メスは生殖能力を維持していました。Hsf5は、レプトテンおよびザイゴテン-パキテン期の細胞の蓄積と減数分裂後の細胞のアポトーシスの増加によって示唆されるように、精子形成中の減数分裂前期1の進行に必要であることを示しています。hsf5（-/-）変異体は、細胞周期、アポトーシス、タンパク質修飾、およびシグナル伝達に関与するかなりの数の遺伝子の性腺の誤調節を示し、精子形成の初期段階におけるHsf5の重要な役割を示しています。"]
[108,30231998,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","dopamine-beta-hydrolase","Cell reports","The Locus Coeruleus Modulates Intravenous General Anesthesia of Zebrafish via a Cooperative Mechanism.",2018,"24(12):3146-3155.e3","[Du WJ et al.]","Zunyi Medical College, Zunyi, China.",30231998,"10.1016/j.celrep.2018.08.046 ","How general anesthesia causes loss of consciousness has been a mystery for decades. It is generally thought that arousal-related brain nuclei, including the locus coeruleus (LC), are involved. Here, by monitoring locomotion behaviors and  neural activities, we developed a larval zebrafish model for studying general anesthesia induced by propofol and etomidate, two commonly used intravenous anesthetics. Local lesion of LC neurons via two-photon laser-based ablation or genetic depletion of norepinephrine (NE; a neuromodulator released by LC neurons) via CRISPR/Cas9-based mutation of dopamine-beta-hydroxylase (dbh) accelerates induction into and retards emergence from general anesthesia. Mechanistically, in vivo whole-cell recording revealed that both anesthetics suppress LC neurons' activity through a cooperative mechanism, inhibiting presynaptic excitatory inputs and inducing GABAA receptor-mediated hyperpolarization of these neurons. Thus, our study indicates that the LC-NE system plays a modulatory role in both induction of and emergence from intravenous general anesthesia.","fish","全身麻酔がどのように意識の喪失を引き起こすかは、何十年もの間謎でした。青斑核（LC）を含む覚醒関連の脳核が関与していると一般的に考えられています。ここでは、運動行動と神経活動を監視することにより、2つの一般的に使用される静脈麻酔薬であるプロポフォールとエトミデートによって誘発される全身麻酔を研究するためのゼブラフィッシュ幼虫モデルを開発しました。ドーパミン-ベータ-ヒドロキシラーゼ（dbh）のCRISPR / Cas9ベースの突然変異を介したノルエピネフリン（NE; LCニューロンによって放出される神経修飾物質）の2光子レーザーベースのアブレーションまたは遺伝的枯渇によるLCニューロンの局所病変は、誘導を加速し、出現を遅らせます全身麻酔から。機械論的に、in vivoの全細胞記録は、両方の麻酔薬が協調メカニズムを通じてLCニューロンの活動を抑制し、シナプス前興奮性入力を阻害し、GABAA受容体を介したこれらのニューロンの過分極を誘発することを明らかにしました。したがって、我々の研究は、LC-NEシステムが静脈内全身麻酔の誘発と出現の両方において調節的役割を果たすことを示している。"]
[109,30089250,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","class II phosphatidylinositol transfer protein (PITP) family member (pitpnc1a)","Cell reports","Pitpnc1a Regulates Zebrafish Sleep and Wake Behavior through Modulation of Insulin-like Growth Factor Signaling.",2018,"24(6):1389-1396","[Ashlin TG et al.]","University College London, London, UK.",30089250,"10.1016/j.celrep.2018.07.012 ","The lipid transporters of the phosphatidylinositol transfer protein (PITP) family dictate phosphoinositide compartmentalization, and specific phosphoinositides play crucial roles in signaling cascades, membrane traffic, ion channel regulation, and actin dynamics. Although PITPs are enriched in the brain, their physiological functions in neuronal signaling pathways in vivo remain ill defined. We describe a CRISPR/Cas9-generated zebrafish mutant in a brain-specific, conserved class II PITP member, pitpnc1a. Zebrafish pitpnc1a mutants are healthy but display widespread aberrant neuronal activity and increased wakefulness across the day-night cycle. The loss of Pitpnc1a increases  insulin-like growth factor (IGF) signaling in the brain, and inhibition of IGF pathways is sufficient to rescue both neuronal and behavioral hyperactivity in pitpnc1a mutants. We propose that Pitpnc1a-expressing neurons alter behavior via  modification of neuro-modulatory IGF that acts on downstream wake-promoting circuits.","fish","ホスファチジルイノシトール転移タンパク質（PITP）ファミリーの脂質トランスポーターは、ホスホイノシチドの区画化を決定し、特定のホスホイノシチドは、シグナル伝達カスケード、膜輸送、イオンチャネル調節、およびアクチンダイナミクスにおいて重要な役割を果たします。PITPは脳内で濃縮されていますが、invivoでの神経シグナル伝達経路におけるそれらの生理学的機能は明確に定義されていません。CRISPR / Cas9で生成されたゼブラフィッシュ変異体について、脳特異的で保存されたクラスIIPITPメンバーであるpitpnc1aについて説明します。ゼブラフィッシュpitpnc1a変異体は健康ですが、広範囲にわたる異常なニューロン活動と昼夜サイクル全体での覚醒の増加を示します。Pitpnc1aの喪失は、脳内のインスリン様成長因子（IGF）シグナル伝達を増加させ、IGF経路の阻害は、pitpnc1a変異体の神経および行動の両方の活動亢進を救うのに十分です。Pitpnc1aを発現するニューロンは、下流の覚醒促進回路に作用する神経調節IGFの修飾を介して行動を変化させることを提案します。"]
[110,29898387,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","tbx5a; downstream elements","Cell reports","Genomic Knockout of Two Presumed Forelimb Tbx5 Enhancers Reveals They Are Nonessential for Limb Development.",2018,"23(11):3146-3151","[Cunningham TJ et al.]","Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, CA, USA.",29898387,"10.1016/j.celrep.2018.05.052 ","A standard approach in the identification of transcriptional enhancers is the use of transgenic animals carrying DNA elements joined to reporter genes inserted randomly in the genome. We examined elements near Tbx5, a gene required for forelimb development in humans and other vertebrates. Previous transgenic studies reported a mammalian Tbx5 forelimb enhancer located in intron 2 containing a putative retinoic acid response element and a zebrafish tbx5a forelimb (pectoral  fin) enhancer located downstream that is conserved from fish to mammals. We used  CRISPR/Cas9 gene editing to knockout the endogenous elements and unexpectedly found that deletion of the intron 2 and downstream elements, either singly or together in double knockouts, resulted in no effect on forelimb development. Our  findings show that reporter transgenes may not identify endogenous enhancers and  that in vivo genetic loss-of-function studies are required, such as CRISPR/Cas9,  which is similar in effort to production of animals carrying reporter transgenes.","fish","転写エンハンサーの同定における標準的なアプローチは、ゲノムにランダムに挿入されたレポーター遺伝子に結合されたDNA要素を運ぶトランスジェニック動物の使用です。ヒトや他の脊椎動物の前肢の発達に必要な遺伝子であるTbx5の近くの要素を調べました。以前のトランスジェニック研究では、推定レチノイン酸応答要素を含むイントロン2にある哺乳類Tbx5前肢エンハンサーと、魚から哺乳類まで保存されている下流にあるゼブラフィッシュtbx5a前肢（胸鰭）エンハンサーが報告されました。CRISPR / Cas9遺伝子編集を使用して内因性要素をノックアウトしましたが、予期せず、イントロン2と下流要素を単独で、またはダブルノックアウトで一緒に削除しても、前肢の発達に影響がないことがわかりました。私たちの調査結果は、レポータートランスジーンが内因性エンハンサーを識別しない可能性があり、レポータートランスジーンを運ぶ動物の生産と同様の努力であるCRISPR / Cas9などのinvivo遺伝子機能喪失研究が必要であることを示しています。"]
[111,30463392,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","runx2","Cells","New Insights into the Runt Domain of RUNX2 in Melanoma Cell Proliferation and Migration.",2018,"7(11)","[Deiana M  et al.]","University of Verona, Verona, Italy.",30463392,"10.3390/cells7110220 ","The mortality rate for malignant melanoma (MM) is very high, since it is highly invasive and resistant to chemotherapeutic treatments. The modulation of some transcription factors affects cellular processes in MM. In particular, a higher expression of the osteogenic master gene RUNX2 has been reported in melanoma cells, compared to normal melanocytes. By analyzing public databases for recurrent RUNX2 genetic and epigenetic modifications in melanoma, we found that the most common RUNX2 genetic alteration that exists in transcription upregulation is, followed by genomic amplification, nucleotide substitution and multiple changes. Additionally, altered RUNX2 is involved in unchecked pathways promoting tumor progression, Epithelial Mesenchymal Transition (EMT), and metastasis. In order to investigate further the role of RUNX2 in melanoma development and to identify a therapeutic target, we applied the CRISPR/Cas9 technique to explore the role of the RUNT domain of RUNX2 in a melanoma cell line. RUNT-deleted cells showed reduced proliferation, increased apoptosis, and reduced EMT features, suggesting the involvement of the RUNT domain in different  pathways. In addition, del-RUNT cells showed a downregulation of genes involved in migration ability. In an in vivo zebrafish model, we observed that wild-type melanoma cells migrated in 81% of transplanted fishes, while del-RUNT cells migrated in 58%. All these findings strongly suggest the involvement of the RUNT  domain in melanoma metastasis and cell migration and indicate RUNX2 as a prospective target in MM therapy.","fish","悪性黒色腫（MM）は侵襲性が高く、化学療法治療に耐性があるため、死亡率は非常に高くなります。いくつかの転写因子の調節は、MMの細胞プロセスに影響を与えます。特に、正常なメラノサイトと比較して、メラノーマ細胞では骨形成マスター遺伝子RUNX2のより高い発現が報告されています。メラノーマにおける再発性のRUNX2遺伝子およびエピジェネティック修飾について公開データベースを分析することにより、転写のアップレギュレーションに存在する最も一般的なRUNX2遺伝子変化は、ゲノム増幅、ヌクレオチド置換、および複数の変化が続くことを発見しました。さらに、変更されたRUNX2は、腫瘍の進行、上皮間葉転換（EMT）、および転移を促進する未チェックの経路に関与しています。メラノーマ発生におけるRUNX2の役割をさらに調査し、治療標的を特定するために、CRISPR / Cas9技術を適用して、メラノーマ細胞株におけるRUNX2のRUNTドメインの役割を調査しました。RUNTが削除された細胞は、増殖の低下、アポトーシスの増加、EMT機能の低下を示し、さまざまな経路にRUNTドメインが関与していることを示唆しています。さらに、del-RUNT細胞は遊走能力に関与する遺伝子のダウンレギュレーションを示しました。インビボゼブラフィッシュモデルでは、野生型メラノーマ細胞が移植された魚の81％で移動し、del-RUNT細胞が58％で移動することを観察しました。これらすべての発見は、黒色腫の転移および細胞移動におけるRUNTドメインの関与を強く示唆しており、MM療法における有望な標的としてのRUNX2を示しています。"]
[112,29450416,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;"," ","Chemical communications","A G-quadruplex motif at the 3' end of sgRNAs improves CRISPR-Cas9 based genome editing efficiency.",2018,"54(19):2377-2380","[Nahar S et al.]","Academy of Scientific & Innovative Research, New Delhi, India.",29450416,"10.1039/c7cc08893k ","Originating as a component of prokaryotic adaptive immunity, the type II CRISPR/Cas9 system has been repurposed for targeted genome editing in various organisms. Although Cas9 can bind and cleave DNA efficiently under in vitro conditions, its activity inside a cell can vary dramatically between targets owing to the differences between genomic loci and the availability of enough Cas9/sgRNA (single guide RNA) complex molecules for cleavage. Most methods have so far relied on Cas9 protein engineering or base modifications in the sgRNA sequence to improve CRISPR/Cas9 activity. Here we demonstrate that a structure based rational design of sgRNAs can enhance the efficiency of Cas9 cleavage in vivo. By appending a naturally forming RNA G-quadruplex motif to the 3' end of sgRNAs we can improve its stability and target cleavage efficiency in zebrafish embryos without inducing off-target activity, thereby underscoring its value in the design of better and optimized genome editing triggers.","fish","原核生物の適応免疫の構成要素として生まれたII型CRISPR / Cas9システムは、さまざまな生物の標的ゲノム編集に再利用されています。Cas9はinvitro条件下で効率的にDNAに結合して切断できますが、細胞内でのその活性は、ゲノム遺伝子座の違いと切断に十分なCas9 / sgRNA（シングルガイドRNA）複合分子の可用性により、ターゲット間で劇的に異なる可能性があります。これまでのところ、ほとんどの方法は、CRISPR / Cas9活性を改善するために、Cas9タンパク質工学またはsgRNA配列の塩基修飾に依存してきました。ここでは、sgRNAの構造ベースの合理的な設計がinvivoでのCas9切断の効率を高めることができることを示しています。sgRNAの3 '末端に自然に形成されるRNAG-quadruplexモチーフを追加することにより、オフターゲットアクティビティを誘発することなく、ゼブラフィッシュ胚の安定性とターゲット切断効率を向上させることができます。これにより、より優れた最適化されたゲノム編集トリガーの設計におけるその価値が強調されます。 。"]
[113,29545372,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","tbx20","Circulation","TBX20 Regulates Angiogenesis Through the Prokineticin 2-Prokineticin Receptor 1 Pathway.",2018,"138(9):913-928","[Meng S et al.]","Houston Methodist Research Institute, TX, USA.",29545372,"10.1161/CIRCULATIONAHA.118.033939 ","BACKGROUND: Angiogenesis is integral for embryogenesis, and targeting angiogenesis improves the outcome of many pathological conditions in patients. TBX20 is a crucial transcription factor for embryonic development, and its deficiency is associated with congenital heart disease. However, the role of TBX20 in angiogenesis has not been described. METHODS: Loss- and gain-of-function approaches were used to explore the role of TBX20 in angiogenesis both in vitro and in vivo. Angiogenesis gene array was used to identify key downstream targets  of TBX20. RESULTS: Unbiased gene array survey showed that TBX20 knockdown profoundly reduced angiogenesis-associated PROK2 (prokineticin 2) gene expression. Indeed, loss of TBX20 hindered endothelial cell migration and in vitro angiogenesis. In a murine angiogenesis model using subcutaneously implanted Matrigel plugs, we observed that TBX20 deficiency markedly reduced PROK2 expression and restricted intraplug angiogenesis. Furthermore, recombinant PROK2  administration enhanced angiogenesis and blood flow recovery in murine hind-limb  ischemia. In zebrafish, transient knockdown of tbx20 by morpholino antisense oligos or genetic disruption of tbx20 by CRISPR/Cas9 impaired angiogenesis. Furthermore, loss of prok2 or its cognate receptor prokr1a also limited angiogenesis. In contrast, overexpression of prok2 or prokr1a rescued the impaired angiogenesis in tbx20-deficient animals. CONCLUSIONS: Our study identifies TBX20 as a novel transcription factor regulating angiogenesis through  the PROK2-PROKR1 (prokineticin receptor 1) pathway in both development and disease and reveals a novel mode of angiogenic regulation whereby the TBX20-PROK2-PROKR1 signaling cascade may act as a \"biological capacitor\" to relay and sustain the proangiogenic effect of vascular endothelial growth factor. This  pathway may be a therapeutic target in the treatment of diseases with dysregulated angiogenesis.","fish","背景：血管新生は胚発生に不可欠であり、血管新生をターゲットにすると、患者の多くの病的状態の結果が改善されます。TBX20は胚発生の重要な転写因子であり、その欠損は先天性心疾患に関連しています。ただし、血管新生におけるTBX20の役割は説明されていません。方法：機能喪失および機能獲得アプローチを使用して、invitroおよびinvivoの両方で血管新生におけるTBX20の役割を調査しました。血管新生遺伝子アレイを使用して、TBX20の主要な下流標的を同定しました。結果：偏りのない遺伝子アレイ調査は、TBX20ノックダウンが血管新生関連PROK2（プロキネチシン2）遺伝子発現を大幅に減少させたことを示しました。実際、TBX20の喪失は、内皮細胞の遊走とinvitroでの血管新生を妨げました。皮下に埋め込まれたマトリゲルプラグを使用したマウス血管新生モデルでは、TBX20の欠損により、PROK2の発現が著しく低下し、プラグ内の血管新生が制限されることが観察されました。さらに、組換えPROK2投与は、マウス後肢虚血における血管新生と血流回復を増強しました。ゼブラフィッシュでは、モルホリノアンチセンスオリゴによるtbx20の一過性ノックダウン、またはCRISPR / Cas9によるtbx20の遺伝的破壊により血管新生が損なわれました。さらに、prok2またはその同族受容体prokr1aの喪失も血管新生を制限しました。対照的に、prok2またはprokr1aの過剰発現は、tbx20欠損動物の血管新生障害を救済しました。結論：私たちの研究は、TBX20を、発生と疾患の両方でPROK2-PROKR1（プロキネチシン受容体1）経路を介して血管新生を調節する新しい転写因子として特定し、TBX20-PROK2-PROKR1シグナル伝達カスケードが血管内皮増殖因子の血管新生促進効果を中継および維持するための「生物学的コンデンサー」。この経路は、血管新生の調節不全を伴う疾患の治療における治療標的となる可能性があります。"]
[114,30539698,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","nodal modulator (nomo)","Current molecular medicine","Loss of the Nodal modulator Nomo results in chondrodysplasia in zebrafish.",2018,"18(7):448-458","[Cao L et al.]","Hunan Normal University, Changsha, Hunan, China.",30539698,"10.2174/1566524019666181212095307 ","BACKGROUND: Transforming growth factor-beta (TGF-beta)/nodal signaling is involved in early embryonic patterning in vertebrates. Nodal modulator (Nomo, also called pM5) is a negative regulator of nodal signaling. Currently, the role  of nomo gene in cartilage development in vertebrates remains unknown. METHODS: Nomo mutants were generated in a knockout model of zebrafish by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) targeting of the fibronectin type III domain. The expression of related genes, which are critical for chondrogenesis, was analyzed  by whole-mount in situ hybridization and qRT-PCR. Whole-mount alcian staining was performed to analyze the cartilage structure. RESULTS: nomo is highly expressed in various tissues including the cartilage. We successfully constructed a zebrafish nomo knockout model. nomo homozygous mutants exhibited varying degrees  of hypoplasia and dysmorphism on 4 and 5 dpf, which is similar to chondrodysplasia in humans. The key genes of cartilage and skeletal development,  including sox9a, sox9b, dlx1a, dlx2a, osx, col10a1, and col11a2 were all downregulated in nomo mutants compared with the wildtype. CONCLUSION: The nomo gene positively regulates the expression of the master regulator and other key development genes involved in bone formation and cartilage development and it is  essential for cartilage development in zebrafish.","fish","背景：トランスフォーミング成長因子-ベータ（TGF-ベータ）/ノードシグナル伝達は、脊椎動物の初期胚のパターン形成に関与しています。結節調節因子（Nomo、pM5とも呼ばれる）は、結節シグナル伝達の負の調節因子です。現在、脊椎動物の軟骨発達におけるノモ遺伝子の役割は不明のままです。方法：ノモ変異体は、ゼブラフィッシュのノックアウトモデルで、フィブロネクチンIII型ドメインを標的とするクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）によって生成されました。軟骨形成に重要な関連遺伝子の発現は、ホールマウントinsituハイブリダイゼーションとqRT-PCRによって分析されました。軟骨構造を分析するために、ホールマウントアルシアン染色を行った。結果：ノモは軟骨を含むさまざまな組織で高度に発現しています。ゼブラフィッシュのノモックアウトモデルの構築に成功しました。nomoホモ接合変異体は、4および5 dpfでさまざまな程度の形成不全および異形性を示しました。これは、ヒトの軟骨異形成症に類似しています。sox9a、sox9b、dlx1a、dlx2a、osx、col10a1、およびcol11a2を含む、軟骨および骨格発達の重要な遺伝子はすべて、野生型と比較してnomo変異体でダウンレギュレートされました。結論：nomo遺伝子は、マスターレギュレーターおよび骨形成と軟骨発達に関与する他の重要な発達遺伝子の発現を積極的に調節し、ゼブラフィッシュの軟骨発達に不可欠です。"]
[115,30082270,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","spastin","Development","BMP- and neuropilin 1-mediated motor axon navigation relies on spastin alternative translation.",2018,"145(17)","[Jardin N  et al.]","Sorbonne Universites, UPMC Universite Paris 06, INSERM, CNRS, Paris, France.",30082270,"10.1242/dev.162701 ","Functional analyses of genes responsible for neurodegenerative disorders have unveiled crucial links between neurodegenerative processes and key developmental  signalling pathways. Mutations in SPG4-encoding spastin cause hereditary spastic  paraplegia (HSP). Spastin is involved in diverse cellular processes that couple microtubule severing to membrane remodelling. Two main spastin isoforms are synthesised from alternative translational start sites (M1 and M87). However, their specific roles in neuronal development and homeostasis remain largely unknown. To selectively unravel their neuronal function, we blocked spastin synthesis from each initiation codon during zebrafish development and performed rescue analyses. The knockdown of each isoform led to different motor neuron and  locomotion defects, which were not rescued by the selective expression of the other isoform. Notably, both morphant neuronal phenotypes were observed in a CRISPR/Cas9 spastin mutant. We next showed that M1 spastin, together with HSP proteins atlastin 1 and NIPA1, drives motor axon targeting by repressing BMP signalling, whereas M87 spastin acts downstream of neuropilin 1 to control motor  neuron migration. Our data therefore suggest that defective BMP and neuropilin 1  signalling may contribute to the motor phenotype in a vertebrate model of spastin depletion.","fish","神経変性疾患の原因となる遺伝子の機能分析により、神経変性プロセスと主要な発達シグナル伝達経路との間の重要な関連性が明らかになりました。SPG4をコードするスパスティンの変異は、遺伝性痙性麻痺（HSP）を引き起こします。スパスティンは、微小管の切断を膜のリモデリングに結び付ける多様な細胞プロセスに関与しています。2つの主要なスパスティンアイソフォームが代替の翻訳開始部位（M1およびM87）から合成されます。ただし、ニューロンの発達と恒常性におけるそれらの特定の役割はほとんど不明のままです。それらの神経機能を選択的に解明するために、ゼブラフィッシュの発生中に各開始コドンからのスパスチン合成をブロックし、レスキュー分析を実行しました。各アイソフォームのノックダウンは、他のアイソフォームの選択的発現によって救済されなかった異なる運動ニューロンと運動障害をもたらしました。特に、両方のモルファントニューロン表現型がCRISPR / Cas9スパスチン変異体で観察されました。次に、M1スパスチンがHSPタンパク質のアトラスチン1およびNIPA1とともに、BMPシグナル伝達を抑制することによって運動軸索のターゲティングを駆動するのに対し、M87スパスチンはニューロピリン1の下流で作用して運動ニューロンの移動を制御することを示しました。したがって、我々のデータは、欠陥のあるBMPおよびニューロピリン1シグナル伝達が、スパスチン枯渇の脊椎動物モデルにおける運動表現型に寄与している可能性があることを示唆している。"]
[116,29604249,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;TALENs;","pcdh10a; pcdh10b","Developmental biology","Requirement of zebrafish pcdh10a and pcdh10b in melanocyte precursor migration.",2018,"444 Suppl 1:S274-S286","[Williams JS et al.]","University of Colorado Anschutz Medical Campus, Aurora, CO, USA.",29604249,"10.1016/j.ydbio.2018.03.022 ","Melanocytes derive from neural crest cells, which are a highly migratory population of cells that play an important role in pigmentation of the skin and epidermal appendages. In most vertebrates, melanocyte precursor cells migrate solely along the dorsolateral pathway to populate the skin. However, zebrafish melanocyte precursors also migrate along the ventromedial pathway, in route to the yolk, where they interact with other neural crest derivative populations. Here, we demonstrate the requirement for zebrafish paralogs pcdh10a and pcdh10b in zebrafish melanocyte precursor migration. pcdh10a and pcdh10b are expressed in a subset of melanocyte precursor and somatic cells respectively, and knockdown and TALEN mediated gene disruption of pcdh10a results in aberrant migration of melanocyte precursors resulting in fully melanized melanocytes that differentiate precociously in the ventromedial pathway. Live cell imaging analysis demonstrates that loss of pchd10a results in a reduction of directed cell migration of melanocyte precursors, caused by both increased adhesion and a loss of cell-cell  contact with other migratory neural crest cells. Also, we determined that the paralog pcdh10b is upregulated and can compensate for the genetic loss of pcdh10a. Disruption of pcdh10b alone by CRISPR mutagenesis results in somite defects, while the loss of both paralogs results in enhanced migratory melanocyte precursor phenotype and embryonic lethality. These results reveal a novel role for pcdh10a and pcdh10b in zebrafish melanocyte precursor migration and suggest that pcdh10 paralogs potentially interact for proper transient migration along the ventromedial pathway.","fish","メラノサイトは神経堤細胞に由来します。神経堤細胞は、皮膚や表皮付属肢の色素沈着に重要な役割を果たす、移動性の高い細胞集団です。ほとんどの脊椎動物では、メラノサイト前駆細胞は背外側経路に沿ってのみ移動し、皮膚に生息します。ただし、ゼブラフィッシュメラノサイト前駆体は腹内側経路に沿って移動し、卵黄に到達し、そこで他の神経紋誘導体集団と相互作用します。ここでは、ゼブラフィッシュメラノサイト前駆体の移行におけるゼブラフィッシュパラログpcdh10aとpcdh10bの要件を示しています。pcdh10aとpcdh10bは、それぞれメラノサイト前駆細胞と体細胞のサブセットで発現し、pcdh10aのノックダウンとTALENを介した遺伝子破壊により、メラノサイト前駆細胞が異常に移動し、腹内側経路で早期に分化する完全にメラニン化したメラノサイトが生じます。生細胞イメージング分析は、pchd10aの喪失が、接着の増加と他の移動性神経堤細胞との細胞間接触の喪失の両方によって引き起こされる、メラノサイト前駆細胞の方向性のある細胞移動の減少をもたらすことを示しています。また、パラログpcdh10bがアップレギュレートされ、pcdh10aの遺伝的損失を補うことができると判断しました。CRISPR変異誘発によるpcdh10bのみの破壊は体節の欠陥をもたらし、両方のパラログの喪失は移動性メラノサイト前駆体の表現型と胚の致死性の増強をもたらします。これらの結果は、ゼブラフィッシュメラノサイト前駆細胞の移動におけるpcdh10aとpcdh10bの新しい役割を明らかにし、pcdh10パラログが腹内側経路に沿った適切な一過性の移動のために相互作用する可能性があることを示唆しています。"]
[117,29208373,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","wnt8a","Developmental biology","Roles of maternal wnt8a transcripts in axis formation in zebrafish.",2018,"434(1):96-107","[Hino H et al.]","Nagoya University, Nagoya, Aichi, Japan.",29208373,"10.1016/j.ydbio.2017.11.016 ","In early zebrafish development, the program for dorsal axis formation begins soon after fertilization. Previous studies suggested that dorsal determinants (DDs) localize to the vegetal pole, and are transported to the dorsal blastomeres in a  microtubule-dependent manner. The DDs activate the canonical Wnt pathway and induce dorsal-specific genes that are required for dorsal axis formation. Among wnt-family genes, only the wnt8a mRNA is reported to localize to the vegetal pole in oocytes and to induce the dorsal axis, suggesting that Wnt8a is a candidate DD. Here, to reveal the roles of maternal wnt8a, we generated wnt8a mutants by transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and established zygotic, maternal, and maternal zygotic wnt8a mutants by germ-line replacement. Zebrafish wnt8a has two open reading frames (ORF1 and ORF2) that are tandemly located in the genome. Although the zygotic ORF1 or ORF2 wnt8a mutants showed little or no axis-formation defects, the ORF1/2 compound mutants showed antero-dorsalized phenotypes, indicating that ORF1 and ORF2 have redundant roles  in ventrolateral and posterior tissue formation. Unexpectedly, the maternal wnt8a ORF1/2 mutants showed no axis-formation defects. The maternal-zygotic wnt8a ORF1/2 mutants showed more severe antero-dorsalized phenotypes than the zygotic mutants. These results indicated that maternal wnt8a is dispensable for the initial dorsal determination, but cooperates with zygotic wnt8a for ventrolateral and posterior tissue formation. Finally, we re-examined the maternal wnt genes and found that Wnt6a is an alternative candidate DD.","fish","初期のゼブラフィッシュの発達では、背軸形成のプログラムは受精後すぐに始まります。以前の研究では、背側決定基（DD）は植物極に局在し、微小管依存的に背側割球に輸送されることが示唆されていました。DDは、標準的なWnt経路をアクティブにし、背軸形成に必要な背特異的遺伝子を誘導します。wntファミリー遺伝子の中で、wnt8a mRNAのみが卵細胞の植物極に局在し、背軸を誘導すると報告されており、Wnt8aがDD候補であることを示唆している。ここでは、母体のwnt8aの役割を明らかにするために、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）によってwnt8a変異体を生成し、生殖系列置換によって接合性、母性、および母性の接合性wnt8a変異体を確立しました。Zebrafish wnt8aには、ゲノム内にタンデムに配置された2つのオープンリーディングフレーム（ORF1およびORF2）があります。接合型ORF1またはORF2wnt8a変異体は軸形成の欠陥をほとんどまたはまったく示さなかったが、ORF1 / 2化合物変異体は前背側の表現型を示し、ORF1およびORF2が腹外側および後部組織形成において冗長な役割を果たしていることを示している。予期せぬことに、母体のwnt8a ORF1 / 2変異体は軸形成の欠陥を示さなかった。母体の接合性wnt8aORF1 / 2変異体は、接合性変異体よりも重度の前背側表現型を示した。これらの結果は、母体のwnt8aが最初の背側の決定に不可欠であるが、腹外側および後部の組織形成のために接合性wnt8aと協力することを示した。最後に、母体のwnt遺伝子を再検討し、Wnt6aが代替候補DDであることを発見しました。"]
[118,29974860,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","zbtb16a etc.","Developmental cell","A Rapid Method for Directed Gene Knockout for Screening in G0 Zebrafish.",2018,"46(1):112-125.e4","[Wu RS et al.]","University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA.",29974860,"10.1016/j.devcel.2018.06.003 ","Zebrafish is a powerful model for forward genetics. Reverse genetic approaches are limited by the time required to generate stable mutant lines. We describe a system for gene knockout that consistently produces null phenotypes in G0 zebrafish. Yolk injection of sets of four CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes redundantly targeting a single gene recapitulated germline-transmitted knockout phenotypes in >90% of G0 embryos for each of 8 test genes. Early embryonic (6 hpf) and stable adult phenotypes were produced. Simultaneous multi-gene knockout  was feasible but associated with toxicity in some cases. To facilitate use, we generated a lookup table of four-guide sets for 21,386 zebrafish genes and validated several. Using this resource, we targeted 50 cardiomyocyte transcriptional regulators and uncovered a role of zbtb16a in cardiac development. This system provides a platform for rapid screening of genes of interest in development, physiology, and disease models in zebrafish.","fish","ゼブラフィッシュはフォワードジェネティクスの強力なモデルです。逆遺伝学的アプローチは、安定した変異株を生成するために必要な時間によって制限されます。G0ゼブラフィッシュで一貫してヌル表現型を生成する遺伝子ノックアウトのシステムについて説明します。単一の遺伝子を重複して標的とする4つのCRISPR / Cas9リボヌクレオプロテイン複合体のセットのヨーク注射は、8つの試験遺伝子のそれぞれについてG0胚の> 90％で生殖細胞伝達ノックアウト表現型を再現しました。初期胚（6 hpf）および安定した成体の表現型が生成されました。同時の複数遺伝子ノックアウトは実行可能でしたが、場合によっては毒性と関連していました。使用を容易にするために、21,386個のゼブラフィッシュ遺伝子の4つのガイドセットのルックアップテーブルを生成し、いくつかを検証しました。このリソースを使用して、50の心筋細胞転写調節因子を標的とし、心臓の発育におけるzbtb16aの役割を明らかにしました。このシステムは、ゼブラフィッシュの発生、生理学、および疾患モデルに関心のある遺伝子を迅速にスクリーニングするためのプラットフォームを提供します。"]
[119,29243319,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","rfx4","Developmental dynamics","Zebrafish Rfx4 controls dorsal and ventral midline formation in the neural tube.",2018,"247(4):650-659","[Sedykh I et al.]","University of Wisconsin, Madison, WI, USA.",29243319,"10.1002/dvdy.24613 ","BACKGROUND: Rfx winged-helix transcription factors, best known as key regulators  of core ciliogenesis, also play ciliogenesis-independent roles during neural development. Mammalian Rfx4 controls neural tube morphogenesis via both mechanisms. RESULTS: We set out to identify conserved aspects of rfx4 gene function during vertebrate development and to establish a new genetic model in which to analyze these mechanisms further. To this end, we have generated frame-shift alleles in the zebrafish rfx4 locus using CRISPR/Cas9 mutagenesis. Using RNAseq-based transcriptome analysis, in situ hybridization and immunostaining we identified a requirement for zebrafish rfx4 in the forming midlines of the caudal neural tube. These functions are mediated, least in part,  through transcriptional regulation of several zic genes in the dorsal hindbrain and of foxa2 in the ventral hindbrain and spinal cord (floor plate). CONCLUSIONS: The midline patterning functions of rfx4 are conserved, because rfx4 regulates transcription of foxa2 and zic2 in zebrafish and in mouse. In contrast, zebrafish rfx4 function is dispensable for forebrain morphogenesis, while mouse rfx4 is required for normal formation of forebrain ventricles in a ciliogenesis-dependent manner. Collectively, this report identifies conserved aspects of rfx4 function and establishes a robust new genetic model for in-depth dissection of these mechanisms. Developmental Dynamics 247:650-659, 2018. (c) 2017 Wiley Periodicals, Inc.","fish","背景：コア毛様体形成の主要な調節因子として最もよく知られているRfx翼状ヘリックス転写因子も、神経発生中に毛様体形成に依存しない役割を果たします。哺乳類のRfx4は、両方のメカニズムを介して神経管の形態形成を制御します。結果：脊椎動物の発育中のrfx4遺伝子機能の保存された側面を特定し、これらのメカニズムをさらに分析するための新しい遺伝子モデルの確立に着手しました。この目的のために、CRISPR / Cas9変異誘発を使用して、ゼブラフィッシュのrfx4遺伝子座にフレームシフト対立遺伝子を生成しました。RNAseqベースのトランスクリプトーム解析、in situハイブリダイゼーション、免疫染色を使用して、尾側神経管の形成正中線におけるゼブラフィッシュrfx4の要件を特定しました。これらの機能は、少なくとも部分的には、背側後脳のいくつかのzic遺伝子と、腹側後脳および脊髄（床板）のfoxa2の転写調節によって媒介されます。結論：rfx4はゼブラフィッシュとマウスのfoxa2とzic2の転写を調節するため、rfx4の正中線のパターン化機能は保存されています。対照的に、ゼブラフィッシュのrfx4機能は前脳の形態形成に不可欠ですが、マウスのrfx4は毛様体形成に依存した前脳室の正常な形成に必要です。まとめると、このレポートは、rfx4機能の保存された側面を識別し、これらのメカニズムの詳細な分析のための堅牢な新しい遺伝子モデルを確立します。Developmental Dynamics 247：650-659、2018。（c）2017 Wiley Periodicals、Inc。"]
[120,30355756,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","pore-forming subunits of an ATP-sensitive potassium channel (Kir6.1, KCNJ8); regulatory subunits of an ATP-sensitive potassium channel (SUR2, ABCC9)","Disease models & mechanisms","Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders.",2018,"11(10)","[Tessadori F et al.]","Hubrecht Institute-KNAW and UMC Utrecht, Utrecht, the Netherlands.",30355756,"10.1242/dmm.035469 ","The zebrafish (Danio rerio) has become a popular vertebrate model organism to study organ formation and function due to its optical clarity and rapid embryonic development. The use of genetically modified zebrafish has also allowed identification of new putative therapeutic drugs. So far, most studies have relied on broad overexpression of transgenes harboring patient-derived mutations  or loss-of-function mutants, which incompletely model the human disease allele in terms of expression levels or cell-type specificity of the endogenous gene of interest. Most human genetically inherited conditions are caused by alleles carrying single nucleotide changes resulting in altered gene function. Introduction of such point mutations in the zebrafish genome would be a prerequisite to recapitulate human disease but remains challenging to this day. We present an effective approach to introduce small nucleotide changes in the zebrafish genome. We generated four different knock-in lines carrying distinct human cardiovascular-disorder-causing missense mutations in their zebrafish orthologous genes by combining CRISPR/Cas9 with a short template oligonucleotide. Three of these lines carry gain-of-function mutations in genes encoding the pore-forming (Kir6.1, KCNJ8) and regulatory (SUR2, ABCC9) subunits of an ATP-sensitive potassium channel (KATP) linked to Cantu syndrome (CS). Our heterozygous zebrafish knock-in lines display significantly enlarged ventricles with enhanced cardiac output and contractile function, and distinct cerebral vasodilation, demonstrating the causality of the introduced mutations for CS. These results demonstrate that introducing patient alleles in their zebrafish orthologs promises a broad application for modeling human genetic diseases, paving the way for new therapeutic strategies using this model organism.","fish","ゼブラフィッシュ（Daniorerio）は、その光学的透明度と急速な胚発生により、器官の形成と機能を研究するための人気のある脊椎動物モデル生物になりました。遺伝子組み換えゼブラフィッシュの使用により、新しい推定治療薬の特定も可能になりました。これまでのところ、ほとんどの研究は、患者由来の変異または機能喪失型変異体を含む導入遺伝子の広範な過剰発現に依存しており、対象の内因性遺伝子の発現レベルまたは細胞型特異性に関してヒトの疾患対立遺伝子を不完全にモデル化しています。ほとんどの人間の遺伝的状態は、遺伝子機能の変化をもたらす単一ヌクレオチドの変化を運ぶ対立遺伝子によって引き起こされます。ゼブラフィッシュのゲノムにそのような点突然変異を導入することは、人間の病気を再現するための前提条件ですが、今日まで挑戦的なままです。ゼブラフィッシュゲノムに小さなヌクレオチドの変化を導入するための効果的なアプローチを提示します。CRISPR / Cas9を短いテンプレートオリゴヌクレオチドと組み合わせることにより、ゼブラフィッシュのオーソロガス遺伝子に異なるヒト心血管障害を引き起こすミスセンス変異を有する4つの異なるノックインラインを生成しました。これらの系統のうち3つは、カントゥ症候群（CS）に関連するATP感受性カリウムチャネル（KATP）の細孔形成（Kir6.1、KCNJ8）および調節（SUR2、ABCC9）サブユニットをコードする遺伝子に機能獲得型変異を持っています。 。私たちのヘテロ接合ゼブラフィッシュノックインラインは、心臓出力と収縮機能が強化された著しく拡大した脳室、および明確な脳血管拡張を示し、CSに導入された変異の因果関係を示しています。これらの結果は、ゼブラフィッシュのオルソログに患者の対立遺伝子を導入することで、ヒトの遺伝病をモデル化するための幅広いアプリケーションが約束され、このモデル生物を使用した新しい治療戦略への道が開かれることを示しています。"]
[121,30355621,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","pbx3","Disease models & mechanisms","Functional testing of a human PBX3 variant in zebrafish reveals a potential modifier role in congenital heart defects.",2018,"11(10)","[Farr GH 3rd et al.]","Seattle Children's Research Institute, Seattle, WA, USA.",30355621,"10.1242/dmm.035972 ","Whole-genome and exome sequencing efforts are increasingly identifying candidate  genetic variants associated with human disease. However, predicting and testing the pathogenicity of a genetic variant remains challenging. Genome editing allows for the rigorous functional testing of human genetic variants in animal models. Congenital heart defects (CHDs) are a prominent example of a human disorder with  complex genetics. An inherited sequence variant in the human PBX3 gene (PBX3 p.A136V) has previously been shown to be enriched in a CHD patient cohort, indicating that the PBX3 p.A136V variant could be a modifier allele for CHDs. Pbx genes encode three-amino-acid loop extension (TALE)-class homeodomain-containing  DNA-binding proteins with diverse roles in development and disease, and are required for heart development in mouse and zebrafish. Here, we used CRISPR-Cas9  genome editing to directly test whether this Pbx gene variant acts as a genetic modifier in zebrafish heart development. We used a single-stranded oligodeoxynucleotide to precisely introduce the human PBX3 p.A136V variant in the homologous zebrafish pbx4 gene (pbx4 p.A131V). We observed that zebrafish that are homozygous for pbx4 p.A131V are viable as adults. However, the pbx4 p.A131V variant enhances the embryonic cardiac morphogenesis phenotype caused by loss of  the known cardiac specification factor, Hand2. Our study is the first example of  using precision genome editing in zebrafish to demonstrate a function for a human disease-associated single nucleotide variant of unknown significance. Our work underscores the importance of testing the roles of inherited variants, not just de novo variants, as genetic modifiers of CHDs. Our study provides a novel approach toward advancing our understanding of the complex genetics of CHDs.","fish","全ゲノムおよびエクソームシーケンシングの取り組みにより、ヒトの疾患に関連する候補遺伝子変異がますます特定されています。ただし、遺伝的変異の病原性を予測してテストすることは依然として困難です。ゲノム編集により、動物モデルにおけるヒトの遺伝子変異の厳密な機能テストが可能になります。先天性心疾患（CHD）は、複雑な遺伝学を伴う人間の障害の顕著な例です。ヒトPBX3遺伝子の継承された配列変異体（PBX3 p.A136V）は、CHD患者コホートで濃縮されていることが以前に示され、PBX3p.A136V変異体がCHDの修飾対立遺伝子である可能性があることを示しています。Pbx遺伝子は、3アミノ酸ループ伸長（TALE）クラスのホメオドメインを含むDNA結合タンパク質をコードし、発達と疾患において多様な役割を果たし、マウスとゼブラフィッシュの心臓の発達に必要です。ここでは、CRISPR-Cas9ゲノム編集を使用して、このPbx遺伝子変異体がゼブラフィッシュの心臓の発達における遺伝子修飾因子として機能するかどうかを直接テストしました。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを使用して、相同ゼブラフィッシュpbx4遺伝子（pbx4 p.A131V）にヒトPBX3p.A136V変異体を正確に導入しました。pbx4p.A131Vがホモ接合であるゼブラフィッシュは成体として生存可能であることが観察されました。ただし、pbx4 p.A131Vバリアントは、既知の心臓仕様因子であるHand2の喪失によって引き起こされる胚性心臓形態形成表現型を強化します。私たちの研究は、ゼブラフィッシュで精密ゲノム編集を使用して、重要性が不明なヒトの疾患に関連する単一ヌクレオチド変異体の機能を実証する最初の例です。私たちの仕事は、CHDの遺伝的修飾因子として、de novoバリアントだけでなく、継承されたバリアントの役割をテストすることの重要性を強調しています。私たちの研究は、CHDの複雑な遺伝学の理解を進めるための新しいアプローチを提供します。"]
[122,30355591,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;"," ","Disease models & mechanisms","CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments.",2018,"11(10)","[Boel A  et al.]","Ghent University, Ghent, Belgium.",30355591,"10.1242/dmm.035352 ","Targeted genome editing by CRISPR/Cas9 is extremely well fitted to generate gene  disruptions, although precise sequence replacement by CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (HDR) suffers from low efficiency, impeding its use for  high-throughput knock-in disease modeling. In this study, we used next-generation sequencing (NGS) analysis to determine the efficiency and reliability of CRISPR/Cas9-mediated HDR using several types of single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) repair templates for the introduction of disease-relevant point mutations in the zebrafish genome. Our results suggest that HDR rates are strongly determined by repair-template composition, with the most influential factor being homology-arm length. However, we found that repair  using ssODNs does not only lead to precise sequence replacement but also induces  integration of repair-template fragments at the Cas9 cut site. We observed that error-free repair occurs at a relatively constant rate of 1-4% when using different repair templates, which was sufficient for transmission of point mutations to the F1 generation. On the other hand, erroneous repair mainly accounts for the variability in repair rate between the different repair templates. To further improve error-free HDR rates, elucidating the mechanism behind this erroneous repair is essential. We show that the error-prone nature of ssODN-mediated repair, believed to act via synthesis-dependent strand annealing (SDSA), is most likely due to DNA synthesis errors. In conclusion, caution is warranted when using ssODNs for the generation of knock-in models or for therapeutic applications. We recommend the application of in-depth NGS analysis to examine both the efficiency and error-free nature of HDR events.This article has an associated First Person interview with the first author of the paper.","fish","CRISPR / Cas9によるターゲットゲノム編集は、遺伝子破壊を生成するのに非常に適していますが、CRISPR / Cas9を介した相同性指向修復（HDR）による正確な配列置換は効率が低く、ハイスループットノックイン疾患モデリングへの使用を妨げます。 。この研究では、次世代シーケンシング（NGS）分析を使用して、疾患関連の点突然変異を導入するためのいくつかのタイプの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）修復テンプレートを使用したCRISPR / Cas9を介したHDRの効率と信頼性を決定しました。ゼブラフィッシュのゲノム。私たちの結果は、HDR率が修復テンプレートの構成によって強く決定され、最も影響力のある要因は相同性アームの長さであることを示唆しています。ただし、ssODNを使用した修復は、正確なシーケンス置換につながるだけでなく、Cas9カットサイトでの修復テンプレートフラグメントの統合も誘導することがわかりました。異なる修復テンプレートを使用すると、エラーのない修復が1〜4％の比較的一定の割合で発生することがわかりました。これは、F1世代への点突然変異の伝達に十分でした。一方、誤った修復は、主に異なる修復テンプレート間の修復率のばらつきを説明します。エラーのないHDRレートをさらに向上させるには、この誤った修復の背後にあるメカニズムを解明することが不可欠です。合成依存鎖アニーリング（SDSA）を介して作用すると考えられている、ssODNを介した修復のエラーが発生しやすい性質は、DNA合成エラーが原因である可能性が最も高いことを示します。結論として、ノックインモデルの生成または治療用途にssODNを使用する場合は、注意が必要です。HDRイベントの効率とエラーのない性質の両方を調べるために、詳細なNGS分析を適用することをお勧めします。この記事には、論文の筆頭著者との関連する一人称インタビューがあります。"]
[123,30061297,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Rb1","Disease models & mechanisms","Cancer modeling by Transgene Electroporation in Adult Zebrafish (TEAZ).",2018,"11(9)","[Callahan SJ et al.]","Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA.",30061297,"10.1242/dmm.034561 ","Transgenic animals are invaluable for modeling cancer genomics, but often require complex crosses of multiple germline alleles to obtain the desired combinations.  Zebrafish models have advantages in that transgenes can be rapidly tested by mosaic expression, but typically lack spatial and temporal control of tumor onset, which limits their utility for the study of tumor progression and metastasis. To overcome these limitations, we have developed a method referred to as Transgene Electroporation in Adult Zebrafish (TEAZ). TEAZ can deliver DNA constructs with promoter elements of interest to drive fluorophores, oncogenes or CRISPR-Cas9-based mutagenic cassettes in specific cell types. Using TEAZ, we created a highly aggressive melanoma model via Cas9-mediated inactivation of Rb1  in the context of BRAF(V600E) in spatially constrained melanocytes. Unlike prior  models that take approximately 4 months to develop, we found that TEAZ leads to tumor onset in approximately 7 weeks, and these tumors develop in fully immunocompetent animals. As the resulting tumors initiated at highly defined locations, we could track their progression via fluorescence, and documented deep invasion into tissues and metastatic deposits. TEAZ can be deployed to other tissues and cell types, such as the heart, with the use of suitable transgenic promoters. The versatility of TEAZ makes it widely accessible for rapid modeling  of somatic gene alterations and cancer progression at a scale not achievable in other in vivo systems.","fish","トランスジェニック動物は、癌ゲノミクスをモデル化するために非常に貴重ですが、多くの場合、目的の組み合わせを得るために複数の生殖細胞系対立遺伝子の複雑な交配が必要です。ゼブラフィッシュモデルには、導入遺伝子をモザイク発現によって迅速にテストできるという利点がありますが、通常、腫瘍の発症の空間的および時間的制御が不足しているため、腫瘍の進行と転移の研究への有用性が制限されます。これらの制限を克服するために、我々は成体ゼブラフィッシュにおける導入遺伝子エレクトロポレーション（TEAZ）と呼ばれる方法を開発しました。TEAZは、特定の細胞タイプでフルオロフォア、癌遺伝子、またはCRISPR-Cas9ベースの変異原性カセットを駆動するための目的のプロモーターエレメントを含むDNAコンストラクトを提供できます。TEAZを使用して、空間的に制約されたメラノサイトのBRAF（V600E）のコンテキストで、Cas9を介したRb1の不活性化を介して非常に攻撃的なメラノーマモデルを作成しました。発生するのに約4か月かかる以前のモデルとは異なり、TEAZは約7週間で腫瘍の発症につながり、これらの腫瘍は完全に免疫能のある動物で発生することがわかりました。結果として生じる腫瘍は高度に定義された場所で開始されたため、蛍光を介してそれらの進行を追跡し、組織および転移性沈着物への深い浸潤を記録することができました。TEAZは、適切なトランスジェニックプロモーターを使用して、心臓などの他の組織や細胞タイプに展開できます。TEAZの多様性により、他のin vivoシステムでは達成できない規模で、体細胞の遺伝子変化や癌の進行を迅速にモデル化するために広く利用できるようになります。"]
[124,30135069,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Niemann-Pick disease type C1 (NPC1)","Disease models & mechanisms","Modeling Niemann-Pick disease type C1 in zebrafish: a robust platform for in vivo screening of candidate therapeutic compounds.",2018,"11(9)","[Tseng WC  et al.]","National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, Bethesda, MD, USA.",30135069,"10.1242/dmm.034165 ","Niemann-Pick disease type C1 (NPC1) is a rare autosomal recessive lysosomal storage disease primarily caused by mutations in NPC1 NPC1 is characterized by abnormal accumulation of unesterified cholesterol and glycolipids in late endosomes and lysosomes. Common signs include neonatal jaundice, hepatosplenomegaly, cerebellar ataxia, seizures and cognitive decline. Both mouse and feline models of NPC1 mimic the disease progression in humans and have been used in preclinical studies of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (2HPbetaCD; VTS-270), a drug that appeared to slow neurological progression in a Phase 1/2 clinical trial. However, there remains a need to identify additional therapeutic  agents. High-throughput drug screens have been useful in identifying potential therapeutic compounds; however, current preclinical testing is time and labor intensive. Thus, development of a high-capacity in vivo platform suitable for screening candidate drugs/compounds would be valuable for compound optimization and prioritizing subsequent in vivo testing. Here, we generated and characterize  two zebrafish npc1-null mutants using CRISPR/Cas9-mediated gene targeting. The npc1 mutants model both the early liver and later neurological disease phenotypes of NPC1. LysoTracker staining of npc1 mutant larvae was notable for intense staining of lateral line neuromasts, thus providing a robust in vivo screen for lysosomal storage. As a proof of principle, we were able to show that treatment of the npc1 mutant larvae with 2HPbetaCD significantly reduced neuromast LysoTracker staining. These data demonstrate the potential value of using this zebrafish NPC1 model for efficient and rapid in vivo optimization and screening of potential therapeutic compounds.This article has an associated First Person interview with the first author of the paper.","fish","ニーマンピック病タイプC1（NPC1）は、主にNPC1の変異によって引き起こされるまれな常染色体劣性リソソーム貯蔵疾患です。NPC1は、後期エンドソームおよびリソソームにおける未エステル化コレステロールおよびグリコリピドの異常な蓄積を特徴とします。一般的な兆候には、新生児黄疸、肝脾腫、小脳性運動失調、発作、認知機能低下などがあります。NPC1のマウスモデルとネコモデルはどちらも、ヒトの疾患進行を模倣しており、フェーズ1/2で神経学的進行を遅らせるように見える薬剤である2-ヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン（2HPbetaCD; VTS-270）の前臨床試験で使用されています。臨床試験。ただし、追加の治療薬を特定する必要があります。ハイスループットの薬物スクリーニングは、潜在的な治療用化合物を特定するのに役立ちました。ただし、現在の前臨床試験は時間と労力を要します。したがって、候補薬物/化合物のスクリーニングに適した大容量のインビボプラットフォームの開発は、化合物の最適化およびその後のインビボ試験の優先順位付けに価値があるであろう。ここでは、CRISPR / Cas9を介した遺伝子ターゲティングを使用して、2つのゼブラフィッシュnpc1-null変異体を生成して特性評価しました。npc1変異体は、NPC1の初期の肝臓と後期の神経疾患の表現型の両方をモデル化します。npc1変異幼虫のLysoTracker染色は、側線ニューロマストの強い染色で注目に値するため、リソソーム蓄積のための堅牢なinvivoスクリーニングを提供します。原理の証明として、npc1変異幼虫を2HPbetaCDで処理すると、ニューロマストのLysoTracker染色が大幅に減少することを示すことができました。これらのデータは、このゼブラフィッシュNPC1モデルを使用して、潜在的な治療用化合物の効率的かつ迅速なin vivo最適化とスクリーニングを行うことの潜在的な価値を示しています。この記事には、論文の筆頭著者との関連する一人称インタビューがあります。"]
[125,29914939,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","kyphoscoliosis peptidase ","Disease models & mechanisms","Transcriptional upregulation of Bag3, a chaperone-assisted selective autophagy factor, in animal models of KY-deficient hereditary myopathy.",2018,"11(7)","[Jokl EJ  et al.]","University of York, York, UK.",29914939,"10.1242/dmm.033225 ","The importance of kyphoscoliosis peptidase (KY) in skeletal muscle physiology has recently been emphasised by the identification of novel human myopathies associated with KY deficiency. Neither the pathogenic mechanism of KY deficiency  nor a specific role for KY in muscle function have been established. However, aberrant localisation of filamin C (FLNC) in muscle fibres has been shown in humans and mice with loss-of-function mutations in the KY gene. FLNC turnover has been proposed to be controlled by chaperone-assisted selective autophagy (CASA),  a client-specific and tension-induced pathway that is required for muscle maintenance. Here, we have generated new C2C12 myoblast and zebrafish models of KY deficiency by CRISPR/Cas9 mutagenesis. To obtain insights into the pathogenic  mechanism caused by KY deficiency, expression of the co-chaperone BAG3 and other  CASA factors was analyzed in the cellular, zebrafish and ky/ky mouse models. Ky-deficient C2C12-derived clones show trends of higher transcription of CASA factors in differentiated myotubes. The ky-deficient zebrafish model (ky(yo1)/ky(yo1) ) lacks overt signs of pathology, but shows significantly increased bag3 and flnca/b expression in embryos and adult muscle. Additionally,  ky(yo1)/ky(yo1) embryos challenged by swimming in viscous media show an inability to further increase expression of these factors in contrast with wild-type controls. The ky/ky mouse shows elevated expression of Bag3 in the non-pathological exterior digitorum longus (EDL) and evidence of impaired BAG3 turnover in the pathological soleus. Thus, upregulation of CASA factors appears to be an early and primary molecular hallmark of KY deficiency.","fish","骨格筋生理学における脊柱後側弯症ペプチダーゼ（KY）の重要性は、KY欠損症に関連する新規のヒト筋障害の同定によって最近強調されています。KY欠損症の病原性メカニズムも筋肉機能におけるKYの特定の役割も確立されていません。ただし、筋線維におけるフィラミンC（FLNC）の異常な局在は、KY遺伝子に機能喪失型変異を有するヒトおよびマウスで示されています。FLNCの代謝回転は、筋肉の維持に必要なクライアント固有の張力誘発経路であるシャペロン支援選択的オートファジー（CASA）によって制御されることが提案されています。ここでは、CRISPR / Cas9突然変異誘発によるKY欠損の新しいC2C12筋芽細胞およびゼブラフィッシュモデルを生成しました。KY欠乏によって引き起こされる病原性メカニズムへの洞察を得るために、コシャペロンBAG3および他のCASA因子の発現を、細胞、ゼブラフィッシュ、およびky / kyマウスモデルで分析しました。Ky欠損C2C12由来クローンは、分化した筋管におけるCASA因子のより高い転写の傾向を示しています。ky欠損ゼブラフィッシュモデル（ky（yo1）/ ky（yo1））は、病状の明白な兆候を欠いていますが、胚と成体の筋肉でbag3とflnca / bの発現が大幅に増加しています。さらに、粘性媒体での水泳によってチャレンジされたky（yo1）/ ky（yo1）胚は、野生型コントロールとは対照的に、これらの因子の発現をさらに増加させることができないことを示しています。ky / kyマウスは、非病的外部指状突起（EDL）でのBag3の発現上昇と、病的ソレウスでのBAG3代謝回転障害の証拠を示しています。したがって、CASA因子のアップレギュレーションは、KY欠損症の初期の主要な分子的特徴であるように思われます。"]
[126,29914980,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","histone-H2A.F/Z-GFP fusion protein","Disease models & mechanisms","Epigenetic regulators Rbbp4 and Hdac1 are overexpressed in a zebrafish model of RB1 embryonal brain tumor, and are required for neural progenitor survival and proliferation.",2018,"11(6)","[Schultz LE et al.]","Iowa State University, Ames, IA, USA.",29914980,"10.1242/dmm.034124 ","In this study, we used comparative genomics and developmental genetics to identify epigenetic regulators driving oncogenesis in a zebrafish retinoblastoma  1 (rb1) somatic-targeting model of RB1 mutant embryonal brain tumors. Zebrafish rb1 brain tumors caused by TALEN or CRISPR targeting are histologically similar to human central nervous system primitive neuroectodermal tumors (CNS-PNETs). Like the human oligoneural OLIG2+/SOX10+ CNS-PNET subtype, zebrafish rb1 tumors show elevated expression of neural progenitor transcription factors olig2, sox10, sox8b and the receptor tyrosine kinase erbb3a oncogene. Comparison of rb1 tumor and rb1/rb1 germline mutant larval transcriptomes shows that the altered oligoneural precursor signature is specific to tumor tissue. More than 170 chromatin regulators were differentially expressed in rb1 tumors, including overexpression of chromatin remodeler components histone deacetylase 1 (hdac1) and retinoblastoma binding protein 4 (rbbp4). Germline mutant analysis confirms that zebrafish rb1, rbbp4 and hdac1 are required during brain development. rb1 is necessary for neural precursor cell cycle exit and terminal differentiation, rbbp4 is required for survival of postmitotic precursors, and hdac1 maintains proliferation of the neural stem cell/progenitor pool. We present an in vivo assay using somatic CRISPR targeting plus live imaging of histone-H2A.F/Z-GFP fusion protein in developing larval brain to rapidly test the role of chromatin remodelers in neural stem and progenitor cells. Our somatic assay recapitulates germline mutant phenotypes and reveals a dynamic view of their roles in neural cell populations. Our study provides new insight into the epigenetic processes that might drive pathogenesis in RB1 brain tumors, and identifies Rbbp4 and its associated chromatin remodeling complexes as potential target pathways to induce  apoptosis in RB1 mutant brain cancer cells.This article has an associated First Person interview with the first author of the paper.","fish","この研究では、比較ゲノミクスと発生遺伝学を使用して、RB1変異胚性脳腫瘍のゼブラフィッシュ網膜芽細胞腫1（rb1）体細胞ターゲティングモデルで発癌を促進するエピジェネティックレギュレーターを特定しました。TALENまたはCRISPRターゲティングによって引き起こされるゼブラフィッシュrb1脳腫瘍は、組織学的にヒト中枢神経系原始神経外胚葉性腫瘍（CNS-PNET）と類似しています。ヒトオリゴニューラルOLIG2 + / SOX10 + CNS-PNETサブタイプと同様に、ゼブラフィッシュrb1腫瘍は、神経前駆細胞転写因子olig2、sox10、sox8bおよび受容体型チロシンキナーゼerbb3a癌遺伝子の発現上昇を示します。rb1腫瘍とrb1 / rb1生殖細胞変異幼虫トランスクリプトームの比較は、変化したオリゴ神経前駆体シグネチャーが腫瘍組織に特異的であることを示しています。170を超えるクロマチンレギュレーターが、クロマチンリモデラー成分であるヒストンデアセチラーゼ1（hdac1）および網膜芽細胞腫結合タンパク質4（rbbp4）の過剰発現を含め、rb1腫瘍で差次的に発現しました。生殖細胞変異分析は、ゼブラフィッシュrb1、rbbp4およびhdac1が脳の発達中に必要であることを確認しています。rb1は神経前駆細胞サイクルの終了と最終分化に必要であり、rbbp4は有糸分裂後の前駆体の生存に必要であり、hdac1は神経幹細胞/前駆体プールの増殖を維持します。体細胞CRISPRターゲティングとヒストン-H2A.F / Z-GFP融合タンパク質のライブイメージングを使用したinvivoアッセイを提示し、神経幹細胞および前駆細胞におけるクロマチンリモデラーの役割を迅速にテストします。私たちの体細胞アッセイは、生殖細胞変異の表現型を再現し、神経細胞集団におけるそれらの役割の動的なビューを明らかにします。私たちの研究は、RB1脳腫瘍の病因を促進する可能性のあるエピジェネティックなプロセスへの新しい洞察を提供し、RB1変異脳腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する潜在的な標的経路としてRbbp4とそれに関連するクロマチンリモデリング複合体を特定します。論文の最初の著者。"]
[127,29590639,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","mitochondrial DNA polymerase (polg); sod1","Disease models & mechanisms","Neutrophil-specific knockout demonstrates a role for mitochondria in regulating neutrophil motility in zebrafish.",2018,"11(3)","[Zhou W et al.]","Purdue University, West Lafayette, IN, USA.",29590639,"10.1242/dmm.033027 ","Neutrophils are fast-moving cells essential for host immune functions. Although they primarily rely on glycolysis for ATP, isolated primary human neutrophils depend on mitochondrial membrane potential for chemotaxis. However, it is not known whether mitochondria regulate neutrophil motility in vivo, and the underlying molecular mechanisms remain obscure. Here, we visualized mitochondria  in an interconnected network that localizes to the front and rear of migrating neutrophils using a novel transgenic zebrafish line. To disrupt mitochondrial function genetically, we established a gateway system harboring the CRISPR/Cas9 elements for tissue-specific knockout. In a transgenic line, neutrophil-specific  disruption of mitochondrial DNA polymerase, polg, significantly reduced the velocity of neutrophil interstitial migration. In addition, inhibiting the mitochondrial electron transport chain or the enzymes that reduce mitochondrial reactive oxygen species also inhibited neutrophil motility. The reduced cell motility that resulted from neutrophil-specific knockout of sod1 was rescued with sod1 mRNA overexpression, or by treating with scavengers of reactive oxygen species. Together, our work has provided the first in vivo evidence that mitochondria regulate neutrophil motility, as well as tools for the functional characterization of mitochondria-related genes in neutrophils and insights into immune deficiency seen in patients with primary mitochondrial disorders.This article has an associated First Person interview with the first author of the paper.","fish","好中球は、宿主の免疫機能に不可欠な動きの速い細胞です。それらは主にATPの糖分解に依存していますが、単離された初代ヒト好中球は化学走性のミトコンドリア膜電位に依存しています。ただし、ミトコンドリアがin vivoで好中球の運動性を調節するかどうかは不明であり、基になる分子メカニズムは不明なままです。ここでは、新しいトランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用して、移動する好中球の前部と後部に局在する相互接続ネットワーク内のミトコンドリアを視覚化しました。ミトコンドリア機能を遺伝的に破壊するために、組織特異的ノックアウト用のCRISPR / Cas9エレメントを含むゲートウェイシステムを確立しました。トランスジェニック系統では、ミトコンドリアDNAポリメラーゼであるpolgの好中球特異的破壊により、好中球間質移動の速度が大幅に低下しました。さらに、ミトコンドリアの電子伝達系またはミトコンドリアの活性酸素種を減少させる酵素を阻害すると、好中球の運動性も阻害されました。sod1の好中球特異的ノックアウトに起因する細胞運動性の低下は、sod1 mRNAの過剰発現によって、または反応性酸素種のスカベンジャーで処理することによって救済されました。一緒に、私たちの仕事は、ミトコンドリアが好中球の運動性を調節するという最初のインビボの証拠、ならびに好中球におけるミトコンドリア関連遺伝子の機能的特徴づけのためのツール、および原発性ミトコンドリア障害の患者に見られる免疫不全への洞察を提供しました。論文の最初の著者との一人称インタビュー。"]
[128,30184072,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","oocyte-specific transcription factor (figla)","Endocrinology","Roles of Figla/figla in Juvenile Ovary Development and Follicle Formation During  Zebrafish Gonadogenesis.",2018,"159(11):3699-3722","[Qin M et al.]","University of Macau, Macau, China.",30184072,"10.1210/en.2018-00648 ","Sex determination and differentiation are complex processes. As a juvenile hermaphrodite or undifferentiated gonochorist, zebrafish undergo a special juvenile ovarian phase during sex differentiation, making it an excellent model for studying early oogenesis and folliculogenesis. We provide lines of evidence at morphological, molecular, and genetic levels for roles of factor in the germline alpha (Figla), an oocyte-specific transcription factor, in early zebrafish gonadogenesis. As in mammals, Figla/figla was also expressed in the gonads and its expression in the ovary was also restricted to early oocytes. Disruption of figla gene by CRISPR/Cas9 led to an all-male phenotype in the mutant. Detailed analysis of early gonadal development showed that the germ cells in the mutant were clustered in cysts and underwent meiosis, forming oocytes at prefollicular chromatin nucleolar (CN) stage (stage IA). However, the subsequent  transition from cystic CN oocytes to individual follicular perinucleolar oocytes  (stage IB) was blocked, resulting in an all-male phenotype in the mutant. The phenotype of figla mutant could not be rescued by estrogen treatment, in contrast to cyp19a1a mutant, and introduction of tp53 mutation also had no effect, unlike  in fancd1 and fancl mutants. Transcriptome analysis revealed that many biological processes and pathways related to germ cell development, especially oogenesis, were upregulated in the presence of Figla and that the regulation of figla expression may involve heat shock proteins. Our results strongly suggest important roles for Figla in juvenile ovary development, especially the formation of individual follicles from cystic oocytes.","fish","性別の決定と差別化は複雑なプロセスです。幼若ヘルマフロダイトまたは未分化のゴノコリストとして、ゼブラフィッシュは性分化中に特別な幼若卵巣相を経験し、初期の卵形成および濾胞形成を研究するための優れたモデルになります。初期のゼブラフィッシュ生殖腺形成における、卵細胞特異的転写因子である生殖細胞系アルファ（Figla）における因子の役割について、形態学的、分子的、および遺伝的レベルで一連の証拠を提供します。哺乳類と同様に、フィグラ/フィグラも性腺で発現し、卵巣での発現も初期卵母細胞に限定されていました。CRISPR / Cas9によるfigla遺伝子の破壊は、変異体のすべての男性の表現型につながりました。初期の性腺発達の詳細な分析は、突然変異体の生殖細胞が嚢胞にクラスター化され、減数分裂を経て、濾胞前クロマチン核小体（CN）段階（段階IA）で卵母細胞を形成することを示した。しかし、その後の嚢胞性CN卵母細胞から個々の卵胞核周囲卵母細胞への移行（ステージIB）はブロックされ、変異体ではすべて男性の表現型が生じました。figla変異体の表現型は、cyp19a1a変異体とは対照的に、エストロゲン処理では救済できず、fancd1およびfancl変異体とは異なり、tp53変異の導入も効果がありませんでした。トランスクリプトーム解析により、生殖細胞の発達、特に卵形成に関連する多くの生物学的プロセスと経路がフィグラの存在下でアップレギュレートされ、フィグラ発現の調節には熱ショックタンパク質が関与している可能性があることが明らかになりました。我々の結果は、若年性卵巣発達、特に嚢胞卵母細胞からの個々の卵胞の形成におけるフィグラの重要な役割を強く示唆している。"]
[129,29766040,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","NMDA receptor (NMDAR) NR1.1 subunit (grin1a) ","eNeuro","The Midline Axon Crossing Decision Is Regulated through an Activity-Dependent Mechanism by the NMDA Receptor.",2018,"5(2)","[Gao J et al.]","University of Utah School of Medicine Salt Lake City, UT, USA.",29766040,"10.1523/ENEURO.0389-17.2018 ","Axon guidance in vertebrates is controlled by genetic cascades as well as by intrinsic activity-dependent refinement of connections. Midline axon crossing is  one of the best studied pathfinding models and is fundamental to the establishment of bilaterally symmetric nervous systems. However, it is not known  whether crossing requires intrinsic activity in axons, and what controls that activity. Further, a mechanism linking neuronal activity and gene expression has  not been identified for axon pathfinding. Using embryonic zebrafish, we found that the NMDA receptor (NMDAR) NR1.1 subunit (grin1a) is expressed in commissural axons. Pharmacological inhibition of grin1a, hypoxia exposure reduction of grin1a expression, or CRISPR knock-down of grin1a leads to defects in midline crossing.  Inhibition of neuronal activity phenocopies the effects of grin1a loss on midline crossing. By combining pharmacological inhibition of the NMDAR with optogenetic stimulation to precisely restore neuronal activity, we observed rescue of midline crossing. This suggests that the NMDAR controls pathfinding by an activity-dependent mechanism. We further show that the NMDAR may act, via modulating activity, on the transcription factor arxa (mammalian Arx), a known regulator of midline pathfinding. These findings uncover a novel role for the NMDAR in controlling activity to regulate commissural pathfinding and identify arxa as a key link between the genetic and activity-dependent regulation of midline axon guidance.","fish","脊椎動物の軸索ガイダンスは、遺伝的カスケードと、固有の活動に依存する接続の改善によって制御されます。正中軸索交差は、最もよく研​​究された経路探索モデルの1つであり、左右対称の神経系の確立の基本です。ただし、交差が軸に固有の活動を必要とするかどうか、およびその活動を制御するものは不明です。さらに、神経活動と遺伝子発現を結びつけるメカニズムは、軸索経路探索のために特定されていません。胚のゼブラフィッシュを使用して、NMDA受容体（NMDAR）NR1.1サブユニット（grin1a）が交連軸索で発現していることを発見しました。grin1aの薬理学的阻害、grin1a発現の低酸素曝露の減少、またはgrin1aのCRISPRノックダウンは、正中線交差の欠陥につながります。ニューロン活動の抑制は、正中線交差に対するgrin1a喪失の影響を表現型コピーします。NMDARの薬理学的阻害と光遺伝学的刺激を組み合わせて神経活動を正確に回復することにより、正中線交差の救済を観察しました。これは、NMDARが活動に依存するメカニズムによって経路探索を制御していることを示唆しています。さらに、NMDARが、調節活性を介して、正中線経路探索の既知の調節因子である転写因子arxa（哺乳類Arx）に作用する可能性があることを示します。これらの調査結果は、交連経路探索を規制する活動の制御におけるNMDARの新しい役割を明らかにし、正中軸軸ガイダンスの遺伝的規制と活動依存的規制の間の重要なリンクとしてarxaを特定します。"]
[130,29777677,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","ush2a","Experimental eye research","Usherin defects lead to early-onset retinal dysfunction in zebrafish.",2018,"173:148-159","[Dona M et al.]","Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands.",29777677,"10.1016/j.exer.2018.05.015 ","Mutations in USH2A are the most frequent cause of Usher syndrome and autosomal recessive nonsyndromic retinitis pigmentosa. To unravel the pathogenic mechanisms underlying USH2A-associated retinal degeneration and to evaluate future therapeutic strategies that could potentially halt the progression of this devastating disorder, an animal model is needed. The available Ush2a knock-out mouse model does not mimic the human phenotype, because it presents with only a mild and late-onset retinal degeneration. Using CRISPR/Cas9-technology, we introduced protein-truncating germline lesions into the zebrafish ush2a gene (ush2a(rmc1): c.2337_2342delinsAC; p.Cys780GlnfsTer32 and ush2a(b1245): c.15520_15523delinsTG; p.Ala5174fsTer). Homozygous mutants were viable and displayed no obvious morphological or developmental defects. Immunohistochemical  analyses with antibodies recognizing the N- or C-terminal region of the ush2a-encoded protein, usherin, demonstrated complete absence of usherin in photoreceptors of ush2a(rmc1), but presence of the ectodomain of usherin at the periciliary membrane of ush2a(b1245)-derived photoreceptors. Furthermore, defects of usherin led to a reduction in localization of USH2 complex members, whirlin and Adgrv1, at the photoreceptor periciliary membrane of both mutants. Significantly elevated levels of apoptotic photoreceptors could be observed in both mutants when kept under constant bright illumination for three days. Electroretinogram (ERG) recordings revealed a significant and similar decrease in both a- and b-wave amplitudes in ush2a(rmc1) as well as ush2a(b1245) larvae as compared to strain- and age-matched wild-type larvae. In conclusion, this study shows that mutant ush2a zebrafish models present with early-onset retinal dysfunction that is exacerbated by light exposure. These models provide a better  understanding of the pathophysiology underlying USH2A-associated RP and a unique  opportunity to evaluate future therapeutic strategies.","fish","USH2Aの変異は、アッシャー症候群および常染色体劣性非症候性網膜色素変性症の最も頻繁な原因です。USH2A関連の網膜変性の根底にある病原性メカニズムを解明し、この壊滅的な障害の進行を潜在的に停止させる可能性のある将来の治療戦略を評価するには、動物モデルが必要です。利用可能なUsh2aノックアウトマウスモデルは、軽度で遅発性の網膜変性のみを示すため、ヒトの表現型を模倣していません。CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、ゼブラフィッシュush2a遺伝子（ush2a（rmc1）：c.2337_2342delinsAC; p.Cys780GlnfsTer32およびush2a（b1245）：c.15520_15523delinsTG; p.Ala5174fsTer）にタンパク質切断生殖細胞系列病変を導入しました。ホモ接合変異体は生存可能であり、明らかな形態学的または発達上の欠陥を示さなかった。ush2aでコードされたタンパク質であるウシェリンのN末端領域またはC末端領域を認識する抗体を用いた免疫組織化学的分析では、ush2a（rmc1）の光受容体にウシェリンが完全に存在しないが、ush2a（b1245）の毛様体膜にウシェリンの外部ドメインが存在することが示されました。 ）由来の光受容体。さらに、アッシャーリンの欠陥は、両方の変異体の光受容体毛様体膜でのUSH2複合体メンバーであるwhirlinとAdgrv1の局在の減少をもたらしました。一定の明るい照明下で3日間維持すると、両方の変異体でアポトーシス光受容体のレベルが大幅に上昇することが観察されました。網膜電図（ERG）の記録は、系統および年齢を一致させた野生型の幼虫と比較して、ush2a（rmc1）およびush2a（b1245）の幼虫のa波とb波の両方の振幅の有意かつ同様の減少を明らかにしました。結論として、この研究は、変異型ush2aゼブラフィッシュモデルが、光曝露によって悪化する早期発症型網膜機能障害を呈することを示しています。これらのモデルは、USH2A関連RPの根底にある病態生理学のより良い理解と、将来の治療戦略を評価するためのユニークな機会を提供します。"]
[131,29655639,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","glia maturation factor beta","Experimental neurology","Glia maturation factor beta is required for reactive gliosis after traumatic brain injury in zebrafish.",2018,"305:129-138","[Yin G et al.]","Southern Medical University, Guangzhou, China.",29655639,"10.1016/j.expneurol.2018.04.008 ","Gliosis is a hallmark of neural pathology that occurs after most forms of central nervous system (CNS) injuries including traumatic brain injury (TBI). Identification of genes that control gliosis may provide novel treatment targets  for patients with diverse CNS injuries. Glia maturation factor beta (GMFB) is crucial in brain development and stress response. In the present study, GMFB was  found to be widely expressed in adult zebrafish telencephalon. A gmfb mutant zebrafish was created using CRISPR/cas9. In the uninjured zebrafish telencephalon, glial fibrillary acidic protein (GFAP) fibers in gmfb mutants were disorganized and shorter than wild type zebrafish. After TBI, transformation of quiescent type I radial glial cells (RGC) to proliferative type II RGCs was significantly suppressed in the gmfb mutant. RGC proliferation and hypertrophy post-TBI was reduced in gmfb mutants, indicating that reactive gliosis was attenuated. TBI-induced acute inflammation was also found to be alleviated in the gmfb mutant. Morphological changes also suggest attenuation of microglial reactive gliosis. In a mouse model of TBI, GMFB expression was increased around the injury site. These GMFB+ cells were identified as astrocytes and microglia. Taken together, the data suggests that GMFB is not only required for normal development of GFAP fibers in the zebrafish telencephalon, but also promotes reactive gliosis after TBI. Our findings provide novel information to help better understand the reactive gliosis process following TBI.","fish","神経膠症は、外傷性脳損傷（TBI）を含むほとんどの中枢神経系（CNS）損傷の後に発生する神経病理の特徴です。神経膠症を制御する遺伝子の同定は、多様な中枢神経系損傷の患者に新しい治療標的を提供する可能性があります。グリア成熟因子ベータ（GMFB）は、脳の発達とストレス反応に重要です。本研究では、GMFBは成体のゼブラフィッシュ終脳で広く発現していることがわかった。gmfb変異ゼブラフィッシュはCRISPR / cas9を使用して作成されました。無傷のゼブラフィッシュ終脳では、gmfb変異体のグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）繊維が無秩序であり、野生型ゼブラフィッシュよりも短かった。TBI後、静止状態のI型放射状グリア細胞（RGC）から増殖性のII型RGCへの形質転換は、gmfb変異体で有意に抑制されました。TBI後のRGC増殖と肥大は、gmfb変異体で減少し、反応性神経膠症が減弱したことを示しています。TBI誘発性の急性炎症もgmfb変異体で軽減されることがわかった。形態学的変化はまた、ミクログリア反応性神経膠症の減弱を示唆している。TBIのマウスモデルでは、GMFBの発現が損傷部位の周囲で増加しました。これらのGMFB +細胞は、星状細胞およびミクログリアとして同定されました。まとめると、データは、GMFBがゼブラフィッシュ終脳におけるGFAP繊維の正常な発達に必要であるだけでなく、TBI後の反応性神経膠症を促進することも示唆しています。私たちの調査結果は、TBI後の反応性神経膠症プロセスをよりよく理解するのに役立つ新しい情報を提供します。"]
[132,29812974,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","mCherry; etc.","FASEB journal","CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.",2018,"32(9):5132-5142","[Luo JJ et al.]","Shantou University Medical College, Shantou, China.",29812974,"10.1096/fj.201800077RR ","Numerous feasible methods for inserting large fragments of exogenous DNA sequences into the zebrafish genome have been developed, as has genome editing technology using programmable nucleases. However, the coding sequences of targeted endogenous genes are disrupted, and the expression patterns of inserted  exogenous genes cannot completely recapitulate those of endogenous genes. Here we describe the establishment of a novel strategy for endogenous promoter-driven and microhomology-mediated end-joining-dependent integration of a donor vector using  clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9. We successfully integrated mCherry into the final coding sequence of targeted genes to generate seamless transgenic zebrafish lines with high efficiency. This novel seamless transgenesis technique not only maintained the integrity of the endogenous gene but also did not disrupt the function of targeted gene. Therefore, our microhomology-mediated end-joining-mediated transgenesis strategy may have broader applications in gene  therapy. Moreover, this novel seamless gene-editing strategy in zebrafish provides a valuable new transgenesis technique, which was driven by endogenous promoters and in vivo animal reporter modes for translational medicine. It is expected to be a standard gene-editing technique in the field of zebrafish, leading to some important breakthroughs for studies in early embryogenesis.-Luo,  J.-J., Bian, W.-P., Liu, Y., Huang, H.-Y., Yin, Q., Yang, X.-J., Pei, D.-S. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy.","fish","プログラム可能なヌクレアーゼを使用したゲノム編集技術と同様に、外因性DNA配列の大きな断片をゼブラフィッシュゲノムに挿入するための多数の実行可能な方法が開発されています。しかし、標的となる内因性遺伝子のコード配列は破壊されており、挿入された外因性遺伝子の発現パターンは、内因性遺伝子の発現パターンを完全に再現することはできません。ここでは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連（Cas）9を使用して、ドナーベクターの内因性プロモーター駆動およびマイクロホモロジー媒介の末端結合依存統合のための新しい戦略の確立について説明します。 mCherryをターゲット遺伝子の最終コーディングシーケンスに組み込んで、シームレスなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を高効率で生成します。この新しいシームレスな遺伝子導入技術は、内因性遺伝子の完全性を維持するだけでなく、標的遺伝子の機能を破壊しませんでした。したがって、私たちのマイクロホモロジーを介した末端結合を介したトランスジェネシス戦略は、遺伝子治療においてより幅広い用途を持つ可能性があります。さらに、ゼブラフィッシュにおけるこの新しいシームレスな遺伝子編集戦略は、翻訳医学のための内因性プロモーターおよびインビボ動物レポーターモードによって推進された、価値のある新しいトランスジェネシス技術を提供します。それはゼブラフィッシュの分野における標準的な遺伝子編集技術であると期待されており、初期胚形成の研究にいくつかの重要なブレークスルーをもたらします-Luo、J.-J.、Bian、W.-P.、Liu、Y。、 Huang、H.-Y.、Yin、Q.、Yang、X.-J.、Pei、D.-S。シームレスな統合戦略を使用したゼブラフィッシュのCRISPR / Cas9ベースのゲノムエンジニアリング。"]
[133,30073783,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","esf1","FEBS journal","The ribosome biogenesis protein Esf1 is essential for pharyngeal cartilage formation in zebrafish.",2018,"285(18):3464-3484","[Chen JY et al.]","Key Laboratory of Marine Drugs (Ocean University of China), Chinese Ministry of Education, Qingdao, China.",30073783,"10.1111/febs.14622 ","Craniofacial malformations are common congenital birth defects and usually caused by abnormal development of the cranial neural crest cells. Some nucleolar ribosome biogenesis factors are implicated in neural crest disorders also known as neurocristopathies. However, the underlying mechanisms linking ribosome biogenesis and neural crest cell (NCC) development remain to be elucidated. Here  we report a novel zebrafish model with a CRISPR/Cas9-generated esf1 mutation, which exhibits severe NCC-derived pharyngeal cartilage loss and defects in the eyes, brain, and heart. The expression of several typical NCC markers, including  sox10, dlx2a, nrp2b, crestin, vgll2a, and sox9a, was reduced in the head of the esf1 mutants, which indicates that esf1 plays a role in the development of zebrafish NCCs. We demonstrate that, similar to the yeast, loss of esf1 in zebrafish leads to defects in 18S rRNA biogenesis and ribosome biogenesis. We also show strong upregulation of p53 signaling as well as apoptosis, and poor proliferation in mutants. Inactivation of p53 rescues the early tissue defects and pharyngeal cartilage loss observed in esf1 mutants, indicating that increased cell death and pharyngeal cartilage defects observed in esf1 mutants are mediated via upregulated p53 signaling pathways. Based on transplantation analysis, we found esf1 functions in NCC in a cell autonomous fashion. Together, our results suggest that esf1 is required for NCC development and pharyngeal cartilage formation. These studies provide a potential model for investigating the relationship between ribosome biogenesis defects and craniofacial neurocristopathies.","fish","頭蓋顔面奇形は一般的な先天性先天性欠損症であり、通常は脳神経堤細胞の異常な発達によって引き起こされます。いくつかの核小体リボソーム生合成因子は、神経クリストパシーとしても知られる神経堤障害に関係しています。ただし、リボソーム生合成と神経堤細胞（NCC）の開発をリンクする基になるメカニズムは解明されていないままです。ここでは、CRISPR / Cas9で生成されたesf1変異を持つ新しいゼブラフィッシュモデルを報告します。これは、NCC由来の重度の咽頭軟骨の喪失と、目、脳、心臓の欠陥を示します。sox10、dlx2a、nrp2b、クレスティン、vgll2a、およびsox9aを含むいくつかの典型的なNCCマーカーの発現は、esf1変異体の頭部で減少しました。これは、esf1がゼブラフィッシュNCCの発生に役割を果たすことを示しています。酵母と同様に、ゼブラフィッシュでesf1が失われると、18SrRNA生合成とリボソーム生合成に欠陥が生じることを示しています。また、p53シグナル伝達の強力なアップレギュレーション、アポトーシス、および変異体の増殖不良も示しています。p53の不活性化は、esf1変異体で観察された初期の組織欠損と咽頭軟骨喪失を救助し、esf1変異体で観察された細胞死と咽頭軟骨欠損の増加が上方制御されたp53シグナル伝達経路を介して媒介されることを示します。移植分析に基づいて、我々はesf1がNCCで細胞自律的に機能することを発見した。一緒に、我々の結果は、esf1がNCCの発達と咽頭軟骨の形成に必要であることを示唆している。これらの研究は、リボソーム生合成の欠陥と頭蓋顔面神経クリストパシーとの関係を調査するための潜在的なモデルを提供します。"]
[134,29175471,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","myostatin (mstna; mstnb)","Fish & shellfish immunology","Deletion of mstna and mstnb impairs the immune system and affects growth performance in zebrafish.",2018,"72:572-580","[Wang C et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, China.",29175471,"10.1016/j.fsi.2017.11.040 ","Myostatin (Mstn) is a negative regulator of muscle development in vertebrates. Although its function in muscle growth has been well studied in mammals and fish, it remains unclear whether or how mstn functions in the immune system. In this study, mstna(-/-) and mstnb(-/-) homozygous zebrafish were firstly generated using CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9). Deletion of mstnb but not mstna enhanced growth performance. Although survival rates under normal conditions were slightly decreased in both strains, mortality after dexamethasone-induced stress was increased by approximately 30%. Furthermore, transcriptional levels of several critical immune-related genes were decreased, and the ability to withstand exposure to pathogenic E. tarda was decreased, compared with that of controls. In mstnb(-/-) but not mstna(-/-) zebrafish, expression of NF-kappaB subunits and several pro-inflammatory cytokines failed to respond to E. tarda exposure except  nfkb1, c-rel and tnfalpha. Taken together, these results indicate that mstnb but  not mstna plays a key role in zebrafish muscle growth. While each paralogue contributes to the response to bacterial insult, mstnb affects the immune system  through activation of the NF-kappaB pathway, and mstna is likely to act upstream  of NF-kappaB at some as yet unidentified target.","fish","ミオスタチン（Mstn）は、脊椎動物の筋肉発達の負の調節因子です。筋肉の成長におけるその機能は哺乳類や魚でよく研究されていますが、mstnが免疫系で機能するかどうか、またはどのように機能するかは不明なままです。この研究では、mstna（-/-）およびmstnb（-/-）ホモ接合ゼブラフィッシュが最初にCRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9）を使用して生成されました。mstnaではなくmstnbを削除すると、成長パフォーマンスが向上しました。通常の条件下での生存率は両方の菌株でわずかに減少しましたが、デキサメタゾン誘発ストレス後の死亡率は約30％増加しました。さらに、いくつかの重要な免疫関連遺伝子の転写レベルが低下し、病原性E.tardaへの曝露に耐える能力が対照と比較して低下しました。mstnb（-/-）ではなくmstna（-/-）ゼブラフィッシュでは、NF-κBサブユニットといくつかの炎症誘発性サイトカインの発現は、nfkb1、c-rel、tnfalphaを除いてE.tarda曝露に反応しませんでした。まとめると、これらの結果は、mstnaではなくmstnbがゼブラフィッシュの筋肉の成長に重要な役割を果たしていることを示しています。各パラログは細菌による傷害への応答に寄与しますが、mstnbはNF-κB経路の活性化を通じて免疫系に影響を及ぼし、mstnaはまだ同定されていないいくつかの標的でNF-κBの上流で作用する可能性があります。"]
[135,30186835,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","over 300 genes implicated in retinal regeneration or degeneration","Frontiers in cell and developmental biology","Multiplexed CRISPR/Cas9 Targeting of Genes Implicated in Retinal Regeneration and Degeneration.",2018,"6:88","[Unal Eroglu A et al.]","Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA.",30186835,"10.3389/fcell.2018.00088 ","Thousands of genes have been implicated in retinal regeneration, but only a few have been shown to impact the regenerative capacity of Muller glia-an adult retinal stem cell with untapped therapeutic potential. Similarly, among nearly 300 genetic loci associated with human retinal disease, the majority remain untested in animal models. To address the large-scale nature of these problems, we are applying CRISPR/Cas9-based genome modification strategies in zebrafish to  target over 300 genes implicated in retinal regeneration or degeneration. Our intent is to enable large-scale reverse genetic screens by applying a multiplexed gene disruption strategy that markedly increases the efficiency of the screening  process. To facilitate large-scale phenotyping, we incorporate an automated reporter quantification-based assay to identify cellular degeneration and regeneration-deficient phenotypes in transgenic fish. Multiplexed gene targeting  strategies can address mismatches in scale between \"big data\" bioinformatics and  wet lab experimental capacities, a critical shortfall limiting comprehensive functional analyses of factors implicated in ever-expanding multiomics datasets.  This report details the progress we have made to date with a multiplexed CRISPR/Cas9-based gene targeting strategy and discusses how the methodologies applied can further our understanding of the genes that predispose to retinal degenerative disease and which control the regenerative capacity of retinal Muller glia cells.","fish","何千もの遺伝子が網膜の再生に関与しているが、未開発の治療の可能性を秘めた成人の網膜幹細胞であるミュラーグリアの再生能力に影響を与えることが示されているのはごくわずかである。同様に、人間の網膜疾患に関連するほぼ300の遺伝子座のうち、大部分は動物モデルでテストされていないままです。これらの問題の大規模な性質に対処するために、ゼブラフィッシュでCRISPR / Cas9ベースのゲノム修飾戦略を適用して、網膜の再生または変性に関与する300を超える遺伝子をターゲットにしています。私たちの意図は、スクリーニングプロセスの効率を著しく向上させる多重化遺伝子破壊戦略を適用することにより、大規模な逆遺伝子スクリーニングを可能にすることです。大規模な表現型を容易にするために、トランスジェニック魚の細胞変性および再生欠損表現型を特定するための自動レポーター定量化ベースのアッセイを組み込んでいます。マルチプレックス遺伝子ターゲティング戦略は、「ビッグデータ」バイオインフォマティクスとウェットラボの実験能力の間のスケールの不一致に対処できます。これは、拡大し続けるマルチオミクスデータセットに関係する要因の包括的な機能分析を制限する重大な不足です。このレポートでは、マルチプレックスCRISPR / Cas9ベースの遺伝子ターゲティング戦略でこれまでに達成した進歩について詳しく説明し、適用された方法論が網膜変性疾患の素因となり、網膜ミュラーグリアの再生能力を制御する遺伝子の理解を深める方法について説明します。細胞。"]
[136,29503817,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","cystathionine ss-synthase (cbsb)","Frontiers in cell and developmental biology","Cystathionine beta-Synthase Is Necessary for Axis Development in Vivo.",2018,"6:14","[Prabhudesai S et al.]","Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA.",29503817,"10.3389/fcell.2018.00014 ","The cystathionine ss-synthase (CBS) is a critical enzyme in the transsulfuration  pathway and is responsible for the synthesis of cystathionine from serine and homocysteine. Cystathionine is a precursor to amino acid cysteine. CBS is also responsible for generation of hydrogen sulfide (H2S) from cysteine. Mutation in CBS enzyme causes homocysteine levels to rise, and gives rise to a condition called hyperhomocysteinuria. To date, numerous mouse knockout models for CBS enzyme has been generated, which show panoply of defects, reflecting the importance of this enzyme in development. In zebrafish, we and others have identified two orthologs of cbs, which we call cbsa and cbsb. Previous gene knockdown studies in zebrafish have reported a function for cbsb ortholog in maintaining ion homeostasis in developing embryos. However, its role in maintaining H2S homeostasis in embryos is unknown. Here, we have performed RNA analysis in whole zebrafish embryos that showed a wide expression pattern for cbsa and cbsb primarily along the embryonic axis of the developing embryo. Loss-of-function analysis using a combination of approaches which include splice  morpholinos and CRISPR/Cas9 genomic engineering show evidence that cbsb ortholog  is responsible for anterior-posterior axis development, and cbsa function is redundant. Cbsb loss of function fish embryos show shortened and bent axis, along with less H2S and more homocysteine, effects resulting from loss of Cbsb. Using a chemical biology approach, we rescued the axis defects with betaine, a compound known to reduce homocysteine levels in plasma, and GYY4137, a long term H2S donor. These results collectively argue that cells along the axis of a developing embryo are sensitive to changes in homocysteine and H2S levels, pathways that are controlled by Cbsb, and thus is essential for development.","fish","シスタチオニンss-シンターゼ（CBS）は、硫酸転移経路の重要な酵素であり、セリンとホモシステインからのシスタチオニンの合成を担っています。シスタチオニンはアミノ酸システインの前駆体です。CBSは、システインからの硫化水素（H2S）の生成にも関与します。CBS酵素の変異はホモシステインレベルを上昇させ、高ホモシステイン尿症と呼ばれる状態を引き起こします。現在までに、CBS酵素の多数のマウスノックアウトモデルが生成されており、開発におけるこの酵素の重要性を反映して、欠陥の全貌を示しています。ゼブラフィッシュでは、私たちと他の人がcbsの2つのオルソログを特定しました。これをcbsaとcbsbと呼びます。ゼブラフィッシュでの以前の遺伝子ノックダウン研究は、発生中の胚のイオン恒常性を維持する上でのcbsbオルソログの機能を報告しています。ただし、胚のH2S恒常性を維持する上でのその役割は不明です。ここでは、ゼブラフィッシュの全胚でRNA分析を行い、主に発生中の胚の胚軸に沿ってcbsaとcbsbの幅広い発現パターンを示しました。スプライスモルホリノとCRISPR / Cas9ゲノムエンジニアリングを含むアプローチの組み合わせを使用した機能喪失分析は、cbsbオルソログが前後軸の発達に関与し、cbsa機能が冗長であることの証拠を示しています。Cbsbの機能喪失魚胚は、Cbsbの喪失に起因する影響として、H2Sが少なく、ホモシステインが多いとともに、軸が短く曲がっています。化学生物学的アプローチを使用して、血漿中のホモシステインレベルを低下させることが知られている化合物であるベタインと長期H2SドナーであるGYY4137で軸欠損を救済しました。これらの結果は、発達中の胚の軸に沿った細胞が、ホモシステインおよびH2Sレベル、Cbsbによって制御される経路の変化に敏感であり、したがって発達に不可欠であるとまとめて主張しています。"]
[137,29295818,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","tyr; gol","G3","Comparison of Various Nuclear Localization Signal-Fused Cas9 Proteins and Cas9 mRNA for Genome Editing in Zebrafish.",2018,"8(3):823-831","[Hu P et al.]","Shanghai Ocean University, China.",29295818,"10.1534/g3.117.300359 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been proven to be an efficient and precise genome editing technology in various organisms. However, the gene editing efficiencies of Cas9 proteins with a nuclear localization signal (NLS) fused to different termini and Cas9 mRNA have not been systematically compared. Here, we compared the ability of Cas9 proteins with NLS fused to the N-, C-, or both the N- and C-termini and N-NLS-Cas9-NLS-C mRNA to target two sites in the tyr gene and two sites in the gol gene related to pigmentation in zebrafish. Phenotypic analysis revealed that  all types of Cas9 led to hypopigmentation in similar proportions of injected embryos. Genome analysis by T7 Endonuclease I (T7E1) assays demonstrated that all types of Cas9 similarly induced mutagenesis in four target sites. Sequencing results further confirmed that a high frequency of indels occurred in the target  sites (tyr1 > 66%, tyr2 > 73%, gol1 > 50%, and gol2 > 35%), as well as various types (more than six) of indel mutations observed in all four types of Cas9-injected embryos. Furthermore, all types of Cas9 showed efficient targeted mutagenesis on multiplex genome editing, resulting in multiple phenotypes simultaneously. Collectively, we conclude that various NLS-fused Cas9 proteins and Cas9 mRNAs have similar genome editing efficiencies on targeting single or multiple genes, suggesting that the efficiency of CRISPR/Cas9 genome editing is highly dependent on guide RNAs (gRNAs) and gene loci. These findings may help to  simplify the selection of Cas9 for gene editing using the CRISPR/Cas9 system.","fish","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9システムは、さまざまな生物における効率的で正確なゲノム編集技術であることが証明されています。ただし、異なる末端とCas9 mRNAに融合した核局在化シグナル（NLS）を伴うCas9タンパク質の遺伝子編集効率は体系的に比較されていません。ここでは、Cas9タンパク質とN-、C-、またはN-とC-末端の両方に融合したNLS、およびN-NLS-Cas9-NLS-C mRNAが、tyr遺伝子の2つの部位と2つの部位を標的とする能力を比較しました。ゼブラフィッシュの色素沈着に関連するgol遺伝子の部位。表現型分析により、すべてのタイプのCas9が、注入された胚の同様の割合で色素脱失を引き起こしたことが明らかになりました。T7エンドヌクレアーゼI（T7E1）アッセイによるゲノム分析は、すべてのタイプのCas9が4つの標的部位で同様に突然変異誘発を誘発したことを示しました。シーケンシングの結果により、ターゲットサイト（tyr1> 66％、tyr2> 73％、gol1> 50％、gol2> 35％）、およびさまざまなタイプ（6つ以上）のインデルで高頻度のインデルが発生したことがさらに確認されました。 4種類すべてのCas9注入胚で観察された突然変異。さらに、すべてのタイプのCas9は、マルチプレックスゲノム編集で効率的な標的突然変異誘発を示し、同時に複数の表現型をもたらしました。まとめると、さまざまなNLS融合Cas9タンパク質とCas9 mRNAは、単一または複数の遺伝子をターゲットとする場合に同様のゲノム編集効率を持っていると結論付け、CRISPR / Cas9ゲノム編集の効率はガイドRNA（gRNA）と遺伝子座に大きく依存していることを示唆しています。これらの発見は、CRISPR / Cas9システムを使用した遺伝子編集のためのCas9の選択を簡素化するのに役立つ可能性があります。"]
[138,30077009,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","ASCL1a; BCL6a; HSP70","Gene","Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system.",2018,"677:273-279","[Putri RR et al.]","Shanghai Ocean University, Shanghai, China.",30077009,"10.1016/j.gene.2018.07.077 ","CRISPR activation (CRISPRa) system is the convenient tool for targeted-gene activation, it has been developed and combined with a lighting-based system that  can control transcription initiation spatially and temporally by utilizing photoreceptor derived from plant Arabidopsis thaliana. A blue light photoreceptor the Cryptochrome 2 (CRY2), and its binding partner CIB1 will dimerize by exposure to the blue light and it has been applied to human cells. However, the application of a combination of these two systems to zebrafish cell is still not  explored. We performed zebrafish gene activation using p65 and VP64 activators in the zebrafish cells (ZF4). Our study demonstrated that we have successfully controlled the transcription level of ASCL1a, BCL6a, and HSP70 genes using blue light-activated CRISPR activation system. The result showed that using this system, mRNA level expression of ASCL1a, BCL6a, and HSP70 genes increased after irradiated under blue light for several hours and significantly different to those which treated in the dark.","fish","CRISPRアクティベーション（CRISPRa）システムは、標的遺伝子のアクティベーションに便利なツールであり、植物シロイヌナズナ由来の光受容体を利用して、空間的および時間的に転写開始を制御できる照明ベースのシステムと組み合わせて開発されました。青色光受容体であるクリプトクロム2（CRY2）とその結合パートナーであるCIB1は、青色光にさらされると二量体化し、ヒト細胞に適用されます。ただし、ゼブラフィッシュ細胞へのこれら2つのシステムの組み合わせの適用はまだ検討されていません。ゼブラフィッシュ細胞（ZF4）でp65およびVP64アクチベーターを使用してゼブラフィッシュ遺伝子の活性化を行いました。私たちの研究は、青色光で活性化されるCRISPR活性化システムを使用して、ASCL1a、BCL6a、およびHSP70遺伝子の転写レベルを正常に制御できることを示しました。結果は、このシステムを使用すると、ASCL1a、BCL6a、およびHSP70遺伝子のmRNAレベルの発現が、青色光の下で数時間照射された後に増加し、暗所で処理されたものとは大幅に異なることを示しました。"]
[139,29843777,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","heterotaxy","Genome medicine","Rare copy number variants analysis identifies novel candidate genes in heterotaxy syndrome patients with congenital heart defects.",2018,"10(1):40","[Liu C et al.]","Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China.",29843777,"10.1186/s13073-018-0549-y ","BACKGROUND: Heterotaxy (Htx) syndrome comprises a class of congenital disorders resulting from malformations in left-right body patterning. Approximately 90% of  patients with heterotaxy have serious congenital heart diseases; as a result, the survival rate and outcomes of Htx patients are not satisfactory. However, the underlying etiology and mechanisms in the majority of Htx cases remain unknown. The aim of this study was to investigate the function of rare copy number variants (CNVs) in the pathogenesis of Htx. METHODS: We collected 63 sporadic Htx patients with congenital heart defects and identified rare CNVs using an Affymetrix CytoScan HD microarray and real-time polymerase chain reaction. Potential candidate genes associated with the rare CNVs were selected by referring to previous literature related to left-right development. The expression patterns and function of candidate genes were further analyzed by whole mount in situ hybridization, morpholino knockdown, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated mutation, and over-expressing methods with zebrafish models. RESULTS: Nineteen rare CNVs were identified for the first time in patients with Htx. These CNVs include 5 heterozygous genic deletions, 4 internal genic duplications, and 10 complete duplications of at least one gene. Further analyses of the 19 rare CNVs identified six novel potential candidate genes (NUMB, PACRG,  TCTN2, DANH10, RNF115, and TTC40) linked to left-right patterning. These candidate genes exhibited early expression patterns in zebrafish embryos. Functional testing revealed that downregulation and over-expression of five candidate genes (numb, pacrg, tctn2, dnah10, and rnf115) in zebrafish resulted in disruption of cardiac looping and abnormal expression of lefty2 or pitx2, molecular markers of left-right patterning. CONCLUSIONS: Our findings show that Htx with congenital heart defects in some sporadic patients may be attributed to  rare CNVs. Furthermore, DNAH10 and RNF115 are Htx candidate genes involved in left-right patterning which have not previously been reported in either humans or animals. Our results also advance understanding of the genetic components of Htx.","fish","背景：ヘテロタキシー（Htx）症候群は、左右の体のパターン形成の奇形に起因する先天性障害のクラスを含みます。ヘテロタキシーの患者の約90％は深刻な先天性心疾患を患っています。その結果、Htx患者の生存率と転帰は満足のいくものではありません。ただし、Htxのケースの大部分の根本的な病因とメカニズムは不明であります。この研究の目的は、Htxの病因におけるまれなコピー数変異体（CNV）の機能を調査することでした。方法：先天性心臓欠陥のある63人の散発性Htx患者を収集し、Affymetrix CytoScanHDマイクロアレイとリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用してまれなCNVを特定しました。まれなCNVに関連する潜在的な候補遺伝子は、左右の発達に関連する以前の文献を参照することによって選択されました。候補遺伝子の発現パターンと機能は、ホールマウントin situハイブリダイゼーション、モルホリノノックダウン、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）を介した変異、およびゼブラフィッシュによる過剰発現法によってさらに分析されました。モデル。結果：19のまれなCNVがHtxの患者で初めて同定されました。これらのCNVには、5つのヘテロ接合性遺伝子欠失、4つの内部遺伝子重複、および少なくとも1つの遺伝子の10の完全な重複が含まれます。19のまれなCNVをさらに分析すると、左右のパターン形成に関連する6つの新しい潜在的な候補遺伝子（NUMB、PACRG、TCTN2、DANH10、RNF115、およびTTC40）が特定されました。これらの候補遺伝子は、ゼブラフィッシュ胚において初期の発現パターンを示した。機能テストにより、ゼブラフィッシュにおける5つの候補遺伝子（numb、pacrg、tctn2、dnah10、およびrnf115）のダウンレギュレーションと過剰発現が、心臓のループの破壊と、左右のパターン形成の分子マーカーであるlefty2またはpitx2の異常な発現をもたらすことが明らかになりました。結論：私たちの調査結果は、一部の散発的な患者に先天性心臓欠陥を伴うHtxがまれなCNVに起因する可能性があることを示しています。さらに、DNAH10とRNF115は、左右のパターン形成に関与するHtx候補遺伝子であり、これまでヒトでも動物でも報告されていませんでした。私たちの結果はまた、Htxの遺伝的要素の理解を促進します。"]
[140,29091294,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","adenosine triphosphate-binding cassette B11 (abcb11b)","Hepatology","Zebrafish abcb11b mutant reveals strategies to restore bile excretion impaired by bile salt export pump deficiency.",2018,"67(4):1531-1545","[Ellis JL et al.]","Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, OH., USA",29091294,"10.1002/hep.29632 ","Bile salt export pump (BSEP) adenosine triphosphate-binding cassette B11 (ABCB11) is a liver-specific ABC transporter that mediates canalicular bile salt excretion from hepatocytes. Human mutations in ABCB11 cause progressive familial intrahepatic cholestasis type 2. Although over 150 ABCB11 variants have been reported, our understanding of their biological consequences is limited by the lack of an experimental model that recapitulates the patient phenotypes. We applied CRISPR/Cas9-based genome editing technology to knock out abcb11b, the ortholog of human ABCB11, in zebrafish and found that these mutants died prematurely. Histological and ultrastructural analyses showed that abcb11b mutant zebrafish exhibited hepatocyte injury similar to that seen in patients with progressive familial intrahepatic cholestasis type 2. Hepatocytes of mutant zebrafish failed to excrete the fluorescently tagged bile acid that is a substrate of human BSEP. Multidrug resistance protein 1, which is thought to play a compensatory role in Abcb11 knockout mice, was mislocalized to the hepatocyte cytoplasm in abcb11b mutant zebrafish and in a patient lacking BSEP protein due to nonsense mutations in ABCB11. We discovered that BSEP deficiency induced autophagy in both human and zebrafish hepatocytes. Treatment with rapamycin restored bile acid excretion, attenuated hepatocyte damage, and extended the life span of abcb11b mutant zebrafish, correlating with the recovery of canalicular multidrug resistance protein 1 localization. CONCLUSIONS: Collectively, these data suggest a model that rapamycin rescues BSEP-deficient phenotypes by prompting alternative transporters to excrete bile salts; multidrug resistance protein 1 is a candidate for such an alternative transporter. (Hepatology 2018;67:1531-1545).","fish","胆汁酸塩排出ポンプ（BSEP）アデノシン三リン酸結合カセットB11（ABCB11）は、肝細胞からの小管胆汁酸塩排泄を仲介する肝臓特異的ABCトランスポーターです。ABCB11のヒト変異は、進行性の家族性肝内胆汁うっ滞2型を引き起こします。150を超えるABCB11変異体が報告されていますが、それらの生物学的結果の理解は、患者の表現型を再現する実験モデルの欠如によって制限されています。CRISPR / Cas9ベースのゲノム編集技術を適用して、ゼブラフィッシュのヒトABCB11のオルソログであるabcb11bをノックアウトし、これらの変異体が早期に死亡することを発見しました。組織学的および超微細構造分析は、abcb11b変異ゼブラフィッシュが進行性家族性肝内胆汁うっ滞2型の患者に見られるのと同様の肝細胞損傷を示したことを示した。変異ゼブラフィッシュの肝細胞は、ヒトBSEPの基質である蛍光標識胆汁酸を排出できなかった。Abcb11ノックアウトマウスで代償的な役割を果たすと考えられている多剤耐性タンパク質1は、abcb11b変異ゼブラフィッシュおよびABCB11のナンセンス変異のためにBSEPタンパク質を欠く患者の肝細胞細胞質に誤って局在化した。BSEP欠損症がヒトとゼブラフィッシュの肝細胞の両方でオートファジーを誘発することを発見しました。ラパマイシンによる治療は、胆汁酸の排泄を回復させ、肝細胞の損傷を軽減し、abcb11b変異ゼブラフィッシュの寿命を延ばし、小管多剤耐性タンパク質1の局在の回復と相関しました。結論：まとめると、これらのデータは、ラパマイシンが代替トランスポーターに胆汁塩を排出するように促すことにより、BSEP欠損表現型を救済するモデルを示唆しています。多剤耐性タンパク質1は、そのような代替トランスポーターの候補です。（肝臓学2018; 67：1531-1545）。"]
[141,30242501,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","ush2a","Human genetics","Knockout of ush2a gene in zebrafish causes hearing impairment and late onset rod-cone dystrophy.",2018,"137(10):779-794","[Han S et al.]","Huazhong University of  Science and Technology, Wuhan, Hubei, China.",30242501,"10.1007/s00439-018-1936-6 ","Most cases of Usher syndrome type II (USH2) are due to mutations in the USH2A gene. There are no effective treatments or ideal animal models for this disease,  and the pathological mechanisms of USH2 caused by USH2A mutations are still unknown. Here, we constructed a ush2a knockout (ush2a(-/-)) zebrafish model using TALEN technology to investigate the molecular pathology of USH2. An early onset auditory disorder and abnormal morphology of inner ear stereocilia were identified in the ush2a(-/-) zebrafish. Consequently, the disruption of Ush2a in  zebrafish led to a hearing impairment, like that in mammals. Electroretinography  (ERG) test indicated that deletion of Ush2a affected visual function at an early  stage, and histological analysis revealed that the photoreceptors progressively degenerated. Rod degeneration occurred prior to cone degeneration in ush2a(-/-) zebrafish, which is consistent with the classical description of the progression  of retinitis pigmentosa (RP). Destruction of the outer segments (OSs) of rods led to the down-regulation of phototransduction cascade proteins at late stage. The expression of Ush1b and Ush1c was up-regulated when Ush2a was null. We also found that disruption of fibronectin assembly at the retinal basement membrane weakened cell adhesion in ush2a(-/-) mutants. In summary, for the first time, we generated a ush2a knockout zebrafish line with auditory disorder and retinal degeneration which mimicked the symptoms of patients, and revealed that disruption of fibronectin assembly may be one of the factors underlying RP. This model may help us to better understand the pathogenic mechanism and find treatment for USH2 in the future.","fish","アッシャー症候群II型（USH2）のほとんどの症例は、USH2A遺伝子の変異によるものです。この病気の効果的な治療法や理想的な動物モデルはなく、USH2A変異によって引き起こされるUSH2の病理学的メカニズムはまだ不明です。ここでは、USH2の分子病理学を調査するために、TALENテクノロジーを使用してush2aノックアウト（ush2a（-/-））ゼブラフィッシュモデルを構築しました。ush2a（-/-）ゼブラフィッシュでは、早期発症の聴覚障害と内耳立体繊毛の異常な形態が確認されました。その結果、ゼブラフィッシュのUsh2aの破壊は、哺乳類のように聴覚障害を引き起こしました。網膜電図（ERG）テストは、Ush2aの削除が初期段階で視覚機能に影響を与えることを示し、組織学的分析は、光受容体が徐々に退化することを明らかにしました。ロッド変性は、ush2a（-/-）ゼブラフィッシュの錐体変性の前に発生しました。これは、網膜色素変性症（RP）の進行に関する古典的な説明と一致しています。桿体の外側のセグメント（OS）の破壊は、後期段階で光伝達カスケードタンパク質のダウンレギュレーションにつながりました。Ush2aがヌルの場合、Ush1bおよびUsh1cの発現がアップレギュレートされました。また、網膜基底膜でのフィブロネクチン集合の破壊がush2a（-/-）変異体の細胞接着を弱めることも発見しました。要約すると、我々は初めて、患者の症状を模倣した聴覚障害と網膜変性を伴うush2aノックアウトゼブラフィッシュラインを生成し、フィブロネクチンアセンブリの破壊がRPの根底にある要因の1つである可能性があることを明らかにしました。このモデルは、病原性のメカニズムをよりよく理解し、将来のUSH2の治療法を見つけるのに役立つ可能性があります。"]
[142,29713869,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Forkhead box E3 (foxe3)","Human genetics","A zebrafish model of foxe3 deficiency demonstrates lens and eye defects with dysregulation of key genes involved in cataract formation in humans.",2018,"137(4):315-328","[Krall M et al.]","University of California San Francisco, San Francisco,  CA, USA.",29713869,"10.1007/s00439-018-1884-1 ","The Forkhead box E3 (FOXE3) gene encodes a transcription factor with a forkhead/winged helix domain that is critical for development of the lens and anterior segment of the eye. Monoallelic and biallelic deleterious sequence variants in FOXE3 cause aphakia, cataracts, sclerocornea and microphthalmia in humans. We used clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 injections to target the foxe3 transcript in zebrafish in order to create an experimental model of loss of function for this gene. Larvae that were homozygous for an indel variant, c.296_300delTGCAG, predicting p.(Val99Alafs*2), demonstrated severe eye defects, including small or absent lenses and microphthalmia. The lenses of the homozygous foxe3 indel mutants showed more intense staining with zl-1 antibody compared to control lenses, consistent with increased lens fiber cell differentiation. Whole genome transcriptome analysis (RNA-Seq) on RNA isolated from wildtype larvae and larvae with eye defects that were putative homozygotes for the foxe3 indel variant found significant dysregulation of genes expressed in the lens and eye whose orthologues are associated with cataracts in human patients, including cryba2a, cryba1l1, mipa and hsf4. Comparative analysis of this RNA-seq data with iSyTE data identified several lens-enriched genes to be down-regulated in foxe3 indel mutants. We also  noted upregulation of lgsn and crygmxl2 and downregulation of fmodb and cx43.4, genes that are expressed in the zebrafish lens, but that are not yet associated with an eye phenotype in humans. These findings demonstrate that this new zebrafish foxe3 mutant model is highly relevant to the study of the gene regulatory networks conserved in vertebrate lens and eye development.","fish","フォークヘッドボックスE3（FOXE3）遺伝子は、水晶体と眼の前眼部の発達に重要なフォークヘッド/翼のあるヘリックスドメインを持つ転写因子をコードします。FOXE3の単対立遺伝子および二対立遺伝子の有害な配列変異体は、ヒトに無水晶体症、白内障、強膜化角膜および小眼球症を引き起こします。この遺伝子の機能喪失の実験モデルを作成するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ Cas9注射を使用してゼブラフィッシュのfoxe3転写産物を標的としました。インデル変異体c.296_300delTGCAGについてホモ接合性であり、p。（Val99Alafs * 2）を予測した幼虫は、小さなレンズまたはレンズの欠如、小眼球症などの重度の眼の欠陥を示しました。ホモ接合型foxe3indel変異体の水晶体は、対照水晶体と比較してzl-1抗体でより強い染色を示し、水晶体線維細胞の分化の増加と一致していました。野生型の幼虫およびfoxe3インデル変異体の推定ホモ接合体である眼の欠陥を有する幼虫から単離されたRNAの全ゲノムトランスクリプトーム分析（RNA-Seq）は、オルソログがヒト患者の白内障に関連する水晶体および眼で発現される遺伝子の有意な調節不全を発見した。 cryba2a、cryba1l1、mipa、hsf4を含みます。このRNA-seqデータとiSyTEデータの比較分析により、foxe3indel変異体でダウンレギュレートされるいくつかのレンズ濃縮遺伝子が特定されました。また、ゼブラフィッシュの水晶体で発現しているが、ヒトの眼の表現型とはまだ関連していない遺伝子であるlgsnとcrygmxl2のアップレギュレーションとfmodbとcx43.4のダウンレギュレーションにも注目しました。これらの発見は、この新しいゼブラフィッシュfoxe3変異体モデルが、脊椎動物の水晶体と眼の発達に保存されている遺伝子調節ネットワークの研究に非常に関連していることを示しています。"]
[143,30016436,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","myomaker","Human molecular genetics","Knockout of myomaker results in defective myoblast fusion, reduced muscle growth  and increased adipocyte infiltration in zebrafish skeletal muscle.",2018,"27(20):3542-3554","[Shi J et al.]","University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA.",30016436,"10.1093/hmg/ddy268 ","The fusion of myoblasts into multinucleated muscle fibers is vital to skeletal muscle development, maintenance and regeneration. Genetic mutations in the Myomaker (mymk) gene cause Carey-Fineman-Ziter syndrome (CFZS) in human populations. To study the regulation of mymk gene expression and function, we generated three mymk mutant alleles in zebrafish using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) technology and analyzed the effects of mymk knockout on muscle development and growth. Our studies demonstrated that knockout of mymk resulted in defective myoblast fusion in zebrafish embryos and increased mortality at larval stage around 35-45 days post-fertilization. The viable homozygous mutants were smaller in size and weighed approximately one-third the weight of the wild type (WT) sibling at 3 months old. The homozygous mutants showed craniofacial deformities, resembling the facial defect observed in human populations with CFZS. Histological analysis  revealed that skeletal muscles of mymk mutants contained mainly small-size fibers and substantial intramuscular adipocyte infiltration. Single fiber analysis revealed that myofibers in mymk mutant were predominantly single-nucleated fibers. However, myofibers with multiple myonuclei were observed, although the number of nuclei per fiber was much less compared with that in WT fibers. Overexpression of sonic Hedgehog inhibited mymk expression in zebrafish embryos and blocked myoblast fusion. Collectively, these studies demonstrated that mymk is essential for myoblast fusion during muscle development and growth.","fish","筋芽細胞の多核筋線維への融合は、骨格筋の発達、維持、再生に不可欠です。Myomaker（mymk）遺伝子の遺伝子変異は、ヒト集団にCarey-Fineman-Ziter症候群（CFZS）を引き起こします。mymk遺伝子の発現と機能の調節を研究するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）テクノロジーを使用して、ゼブラフィッシュで3つのmymk変異対立遺伝子を生成し、mymkノックアウトが筋肉の発達と成長に及ぼす影響を分析しました。私たちの研究は、mymkのノックアウトがゼブラフィッシュ胚の筋芽細胞融合の欠陥をもたらし、受精後約35〜45日の幼虫期の死亡率を増加させることを示しました。生存可能なホモ接合変異体はサイズが小さく、生後3か月の野生型（WT）兄弟の約3分の1の重さでした。ホモ接合変異体は頭蓋顔面奇形を示し、CFZSのヒト集団で観察された顔面欠損に似ていた。組織学的分析により、mymk変異体の骨格筋には、主に小さなサイズの繊維と実質的な筋肉内脂肪細胞浸潤が含まれていることが明らかになりました。単繊維分析は、mymk変異体の筋線維が主に単核線維であることを明らかにした。しかし、複数の筋核を有する筋線維が観察されたが、線維あたりの核の数は、WT線維のものと比較してはるかに少なかった。ソニックヘッジホッグの過剰発現は、ゼブラフィッシュ胚におけるmymk発現を阻害し、筋芽細胞融合をブロックしました。まとめると、これらの研究は、mymkが筋肉の発達と成長の間の筋芽細胞融合に不可欠であることを示しました。"]
[144,29506241,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","paired-like homeodomain 2 (pitx2)","Human molecular genetics","PITX2 deficiency and associated human disease: insights from the zebrafish model.",2018,"27(10):1675-1695","[Hendee KE et al.]","Medical College of Wisconsin and Children's Hospital of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA.",29506241,"10.1093/hmg/ddy074 ","The PITX2 (paired-like homeodomain 2) gene encodes a bicoid-like homeodomain transcription factor linked with several human disorders. The main associated congenital phenotype is Axenfeld-Rieger syndrome, type 1, an autosomal dominant condition characterized by variable defects in the anterior segment of the eye, an increased risk of glaucoma, craniofacial dysmorphism and dental and umbilical  anomalies; in addition to this, one report implicated PITX2 in ring dermoid of the cornea and a few others described cardiac phenotypes. We report three novel PITX2 mutations-c.271C > T, p.(Arg91Trp); c.259T > C, p.(Phe87Leu); and c.356delA, p.(Gln119Argfs*36)-identified in independent families with typical Axenfeld-Rieger syndrome characteristics and some unusual features such as corneal guttata, Wolf-Parkinson-White syndrome, and hyperextensibility. To gain further insight into the diverse roles of PITX2/pitx2 in vertebrate development,  we generated various genetic lesions in the pitx2 gene via TALEN-mediated genome  editing. Affected homozygous zebrafish demonstrated congenital defects consistent with the range of PITX2-associated human phenotypes: abnormal development of the  cornea, iris and iridocorneal angle; corneal dermoids; and craniofacial dysmorphism. In addition, via comparison of pitx2M64* and wild-type embryonic ocular transcriptomes we defined molecular changes associated with pitx2 deficiency, thereby implicating processes potentially underlying disease pathology. This analysis identified numerous affected factors including several members of the Wnt pathway and collagen types I and V gene families. These data further support the link between PITX2 and the WNT pathway and suggest a new role in regulation of collagen gene expression during development.","fish","PITX2（ペアのようなホメオドメイン2）遺伝子は、いくつかの人間の障害に関連するbicoidのようなホメオドメイン転写因子をコードします。主な関連する先天性表現型は、Axenfeld-Rieger症候群、1型、前眼部のさまざまな欠陥、緑内障、頭蓋顔面奇形、歯および臍の異常のリスクの増加を特徴とする常染色体優性疾患です。これに加えて、ある報告では角膜の類皮嚢胞にPITX2が関与しており、他のいくつかの報告では心臓の表現型が説明されています。3つの新規PITX2変異を報告します-c.271C> T、p。（Arg91Trp）; c.259T> C、p。（Phe87Leu）; およびc.356delA、p。（Gln119Argfs * 36）-典型的なAxenfeld-Rieger症候群の特徴と、角膜グッタタ、Wolf-Parkinson-White症候群、過伸展性などのいくつかの異常な特徴を持つ独立した家族で特定されています。脊椎動物の発達におけるPITX2 / pitx2の多様な役割についてさらに洞察を得るために、TALENを介したゲノム編集を介してpitx2遺伝子にさまざまな遺伝的病変を生成しました。影響を受けたホモ接合性ゼブラフィッシュは、PITX2関連のヒト表現型の範囲と一致する先天性欠損症を示しました。角膜、虹彩、虹彩角膜角の異常な発達。角膜類皮; 頭蓋顔面奇形。さらに、pitx2M64 *と野生型胚性眼トランスクリプトームの比較により、pitx2欠損症に関連する分子変化を定義し、それによって潜在的に疾患の病理の根底にあるプロセスを示唆しました。この分析により、Wnt経路のいくつかのメンバー、コラーゲンタイプIおよびV遺伝子ファミリーを含む多数の影響を受けた要因が特定されました。これらのデータは、PITX2とWNT経路の間のリンクをさらにサポートし、開発中のコラーゲン遺伝子発現の調節における新しい役割を示唆しています。"]
[145,29293958,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","cdc14a","Human molecular genetics","CDC14A phosphatase is essential for hearing and male fertility in mouse and human.",2018,"27(5):780-798","[Imtiaz A et al.]","National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH, Bethesda, MD, USA.",29293958,"10.1093/hmg/ddx440 ","The Cell Division-Cycle-14 gene encodes a dual-specificity phosphatase necessary  in yeast for exit from mitosis. Numerous disparate roles of vertebrate Cell Division-Cycle-14 (CDC14A) have been proposed largely based on studies of cultured cancer cells in vitro. The in vivo functions of vertebrate CDC14A are largely unknown. We generated and analyzed mutations of zebrafish and mouse CDC14A, developed a computational structural model of human CDC14A protein and report four novel truncating and three missense alleles of CDC14A in human families segregating progressive, moderate-to-profound deafness. In five of these families segregating pathogenic variants of CDC14A, deaf males are infertile, while deaf females are fertile. Several recessive mutations of mouse Cdc14a, including a CRISPR/Cas9-edited phosphatase-dead p.C278S substitution, result in substantial perinatal lethality, but survivors recapitulate the human phenotype of deafness and male infertility. CDC14A protein localizes to inner ear hair cell kinocilia, basal bodies and sound-transducing stereocilia. Auditory hair cells of postnatal Cdc14a mutants develop normally, but subsequently degenerate causing deafness. Kinocilia of germ-line mutants of mouse and zebrafish have normal lengths, which does not recapitulate the published cdc14aa knockdown morphant phenotype of short kinocilia. In mutant male mice, degeneration of seminiferous tubules and spermiation defects result in low sperm count, and abnormal sperm motility and morphology. These findings for the first time define a new monogenic syndrome of deafness and male infertility revealing an absolute requirement in vivo of vertebrate CDC14A phosphatase activity for hearing and male fertility.","fish","Cell Division-Cycle-14遺伝子は、酵母で有糸分裂から抜け出すために必要な二重特異性ホスファターゼをコードしています。脊椎動物の細胞分裂-サイクル-14（CDC14A）の多くの異なる役割が、主にinvitroでの培養癌細胞の研究に基づいて提案されてきました。脊椎動物CDC14Aのinvivo機能はほとんど知られていません。ゼブラフィッシュとマウスCDC14Aの変異を生成および分析し、ヒトCDC14Aタンパク質の計算構造モデルを開発し、進行性の中等度から重度の難聴を分離するヒト家族におけるCDC14Aの4つの新規切り捨ておよび3つのミスセンス対立遺伝子を報告します。CDC14Aの病原性変異体を分離しているこれらの家族のうちの5つでは、聴覚障害者の男性は不妊であり、聴覚障害者の女性は肥沃です。CRISPR / Cas9編集ホスファターゼ死滅p.C278S置換を含む、マウスCdc14aのいくつかの劣性突然変異は、実質的な周産期致死性をもたらしますが、生存者は、聴覚障害と男性不妊の人間の表現型を再現します。CDC14Aタンパク質は、内耳毛細胞のキノシリア、基底体、および音を伝達するステレオシリアに局在します。出生後のCdc14a変異体の聴覚毛細胞は正常に発達しますが、その後変性して難聴を引き起こします。マウスとゼブラフィッシュの生殖系列変異体の運動毛は正常な長さを持っており、短い運動毛の公開されたcdc14aaノックダウンモルファント表現型を再現していません。変異型雄マウスでは、半腎尿細管の変性と精子形成の欠陥により、精子数が少なくなり、精子の運動性と形態が異常になります。これらの発見は、難聴と男性不妊の新しい単一遺伝子症候群を初めて定義し、聴覚と男性不妊のための脊椎動物CDC14Aホスファターゼ活性のinvivoでの絶対的な要件を明らかにしています。"]
[146,29285825,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","WDR63","Human mutation","Targeted copy number screening highlights an intragenic deletion of WDR63 as the  likely cause of human occipital encephalocele and abnormal CNS development in zebrafish.",2018,"39(4):495-505","[Hofmeister W  et al.]","Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden.",29285825,"10.1002/humu.23388 ","Congenital malformations affecting the neural tube can present as isolated malformations or occur in association with other developmental abnormalities and  syndromes. Using high-resolution copy number screening in 66 fetuses with neural  tube defects, we identified six fetuses with likely pathogenic mutations, three aneuploidies (one trisomy 13 and two trisomy 18) and three deletions previously reported in NTDs (one 22q11.2 deletion and two 1p36 deletions) corresponding to 9% of the cohort. In addition, we identified five rare deletions and two duplications of uncertain significance including a rare intragenic heterozygous in-frame WDR63 deletion in a fetus with occipital encephalocele. Whole genome sequencing verified the deletion and excluded known pathogenic variants. The deletion spans exons 14-17 resulting in the expression of a protein missing the third and fourth WD-repeat domains. These findings were supported by CRISPR/Cas9-mediated somatic deletions in zebrafish. Injection of two different sgRNA-pairs targeting relevant intronic regions resulted in a deletion mimicking  the human deletion and a concomitant increase of abnormal embryos with body and brain malformations (41%, n = 161 and 62%, n = 224, respectively), including a sac-like brain protrusion (7% and 9%, P < 0.01). Similar results were seen with overexpression of RNA encoding the deleted variant in zebrafish (total abnormal;  46%, n = 255, P < 0.001) compared with the overexpression of an equivalent amount of wild-type RNA (total abnormal; 3%, n = 177). We predict the in-frame WDR63 deletion to result in a dominant negative or gain-of-function form of WDR63. These are the first findings supporting a role for WDR63 in encephalocele formation.","fish","神経管に影響を与える先天性奇形は、孤立した奇形として現れるか、他の発達異常や症候群に関連して発生する可能性があります。神経管欠損のある66人の胎児で高解像度のコピー数スクリーニングを使用して、病原性突然変異の可能性がある6人の胎児、3つの異数性（1つは13トリソミーと2つは18トリソミー）、およびNTDで以前に報告された3つの欠失（1つは22q11.2欠失、2つはコホートの9％に対応する1p36の削除）。さらに、後頭脳細胞を有する胎児におけるまれな遺伝子内ヘテロ接合性インフレームWDR63欠失を含む、5つのまれな欠失と重要性が不確かな2つの重複を特定しました。全ゲノム配列決定により、欠失が確認され、既知の病原性多様体が除外されました。欠失はエクソン14-17にまたがり、3番目と4番目のWDリピートドメインを欠くタンパク質の発現をもたらします。これらの発見は、ゼブラフィッシュにおけるCRISPR / Cas9を介した体細胞欠失によって裏付けられました。関連するイントロニック領域をターゲットとする2つの異なるsgRNAペアの注入により、人間の削除を模倣した削除と、それに伴う身体および脳の奇形を伴う異常な胚の増加（それぞれ、41％、n = 161および62％、n = 224）が発生しました。嚢状の脳突起（7％および9％、P <0.01）。同様の結果が、ゼブラフィッシュの削除されたバリアントをコードするRNAの過剰発現（合計異常; 46％、n = 255、P <0.001）と、同量の野生型RNAの過剰発現（合計異常; 3％、n）で見られました。 = 177）。インフレームのWDR63の削除により、ドミナントネガティブまたは機能獲得型のWDR63が生じると予測します。これらは、脳瘤形成におけるWDR63の役割を支持する最初の発見です。"]
[147,29483827,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","family with sequence similarity 60, member A, like (fam60al)","International journal of biological sciences","Fam60al as a novel factor involved in reprogramming of somatic cell nuclear transfer in zebrafish (Danio rerio).",2018,"14(1):78-86","[Hu H et al.]","Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China.",29483827,"10.7150/ijbs.22426 ","The main reason for abnormal development of cloned animals or embryos, and inefficient animal cloning, is a poor understanding of the reprogramming mechanism. To better comprehend reprogramming and subsequent generation of pluripotent stem cells, we must investigate factors related to reprogramming of somatic cells as nuclear donors. As we know, fam60al (family with sequence similarity 60, member A, like) is a coding gene only found in zebrafish and frog  (Xenopus laevis) among vertebrates. However, until now, its functions have remained unknown. Here, we generated a zebrafish fam60al(-/-) mutant line using transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and found that both nanog and klf4b expression significantly decreased while myca expression significantly increased in fam60al(-/-) mutant embryos. Concurrently, we also uncovered that in developmentally arrested embryos of somatic cell nuclear transfer, nanog, klf4b and myca expression was down-regulated, accompanying a decrease of fam60al expression. Interestingly, we identified a long noncoding RNA (lncRNA) of fam60al, named fam60al-AS, which negatively regulated fam60al by forming double-stranded RNA (dsRNA). RNase protection assay and real-time PCR confirmed these findings. Taken together, these results suggest that fam60al is a novel factor related to the reprogramming of somatic cell nuclear transfer in zebrafish, which is regulated by its reverse lncRNA.","fish","クローン動物または胚の異常な発達、および非効率的な動物のクローン作成の主な理由は、再プログラミングメカニズムの理解が不十分であるためです。再プログラミングとそれに続く多能性幹細胞の生成をよりよく理解するには、核ドナーとしての体細胞の再プログラミングに関連する要因を調査する必要があります。ご存知のように、fam60al（配列類似性60のファミリー、メンバーAなど）は、脊椎動物のゼブラフィッシュとカエル（Xenopus laevis）にのみ見られるコーディング遺伝子です。しかし、これまでその機能は不明のままでした。ここでは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を使用してゼブラフィッシュfam60al（-/-）変異株を生成し、fam60al（-/-）変異胚でmyca発現が有意に増加する一方で、nanogとklf4bの両方の発現が有意に減少することを発見しました。同時に、体細胞核移植の発生的に停止した胚では、fam60alの発現の減少に伴い、nanog、klf4b、mycaの発現がダウンレギュレートされていることも明らかになりました。興味深いことに、fam60al-ASという名前のfam60alの長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）を特定しました。これは、二本鎖RNA（dsRNA）を形成することによってfam60alを負に調節します。RNaseプロテクションアッセイとリアルタイムPCRにより、これらの所見が確認されました。まとめると、これらの結果は、fam60alがゼブラフィッシュの体細胞核移植の再プログラミングに関連する新しい因子であり、その逆lncRNAによって調節されていることを示唆しています。"]
[148,29669692,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","lbx2","International journal of cardiology","Identification of LBX2 as a novel causal gene of atrial septal defect.",2018,"265:188-194","[Wang J et al.]","Capital Medical University, Beijing, China.",29669692,"10.1016/j.ijcard.2018.04.038 ","BACKGROUND: Atrial septal defect (ASD) is one of the most common cardiac malformations worldwide. Several genes have been identified so far, which can merely explain small proportion of all the cases, therefore, it is anticipated that there are additional genes causing ASD. The aims of this study were to identify the causal gene of ostium secundum atrial septal defect (ASDII) in a Chinese family. METHODS: Whole exome sequencing was performed in three affected members and one control in the ASDII family. We screened mutations of LBX2 in 300 unrelated ASD patients and validated in 400 normal controls by Sanger sequencing. LBX2 knockout zebrafish was generated by CRISPR/Cas9 to detect whether lbx2 deficiency influenced cardiac development. RESULTS: A rare missense mutation in LBX2 (c.A403G: p.K135E) was identified as the pathogenic cause of ASD. Subsequent mutation screening revealed two missense variants in 3 of 300 sporadic patients.  We observed expanded size of atrium and ventricle in LBX2 knockout zebrafish through hematoxylin-eosin staining, more incompact distribution of cardiac myocytes was also discovered in homozygote compared with in wildtype. Furthermore, we performed in situ hybridization of crip2 gene to trace the cardiac neural crest cells in the embryo stage and found that the migration of neural crest cells was obviously delayed in the homozygotes. CONCLUSIONS: We identified LBX2 for the first time as a pathogenic gene of ASDII. LBX2 deficiency may cause abnormal development of heart through influencing the migration of neural crest cells and affect the process of cardiac septation.","fish","背景：心房中隔欠損症（ASD）は、世界中で最も一般的な心臓奇形の1つです。これまでにいくつかの遺伝子が同定されており、それはすべての症例のごく一部を説明するだけであり、したがって、ASDを引き起こす追加の遺伝子があると予想されます。この研究の目的は、中国の家族における二次口心房中隔欠損症（ASDII）の原因遺伝子を特定することでした。方法：全エクソームシーケンスは、影響を受けた3人のメンバーとASDIIファミリーの1人のコントロールで実行されました。300人の無関係なASD患者でLBX2の変異をスクリーニングし、サンガーシーケンシングによって400人の正常なコントロールで検証しました。LBX2ノックアウトゼブラフィッシュは、lbx2の欠損が心臓の発達に影響を与えるかどうかを検出するためにCRISPR / Cas9によって生成されました。結果：LBX2（c.A403G：p.K135E）のまれなミスセンス変異がASDの病原性の原因として特定されました。その後の突然変異スクリーニングにより、300人の散発性患者のうち3人に2つのミスセンス変異が明らかになった。ヘマトキシリン-エオジン染色により、LBX2ノックアウトゼブラフィッシュの心房と心室のサイズが拡大していることを観察しました。ホモ接合体では、野生型と比較して、よりコンパクトでない心筋細胞の分布も発見されました。さらに、crip2遺伝子のinsituハイブリダイゼーションを行って胚期の心臓神経紋細胞を追跡し、ホモ接合体では神経紋細胞の移動が明らかに遅延していることを発見しました。結論：LBX2をASDIIの病原性遺伝子として初めて同定しました。LBX2の欠損は、神経堤細胞の移動に影響を与えることで心臓の異常な発達を引き起こし、心臓の隔膜のプロセスに影響を与える可能性があります。"]
[149,30551684,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","leptin a","International journal of molecular sciences","Zebrafish Mutants Carrying Leptin a (lepa) Gene Deficiency Display Obesity, Anxiety, Less Aggression and Fear, and Circadian Rhythm and Color Preference Dysregulation.",2018,"19(12)","[Audira G et al.]","Chung Yuan Christian University, Chung-Li, Taiwan.",30551684,"10.3390/ijms19124038 ","Leptin, a hormone secreted by peripheral adipose tissues, regulates the appetite  in animals. Recently, evidence has shown that leptin also plays roles in behavioral response in addition to controlling appetite. In this study, we examined the potential function of leptin on non-appetite behaviors in zebrafish  model. By using genome editing tool of Transcription activator-like effector nuclease (TALEN), we successfully knocked out leptin a (lepa) gene by deleting 4  bp within coding region to create a premature-translation stop. Morphological and appetite analysis showed the lepa KO fish display a phenotype with obese, good appetite and elevation of Agouti-related peptide (AgRP) and Ghrelin hormones, consistent with the canonical function of leptin in controlling food intake. By multiple behavior endpoint analyses, including novel tank, mirror biting, predator avoidance, social interaction, shoaling, circadian rhythm, and color preference assay, we found the lepa KO fish display an anxiogenic phenotype showing hyperactivity with rapid swimming, less freezing time, less fear to predator, loose shoaling area forming, and circadian rhythm and color preference  dysregulations. Using biochemical assays, melatonin, norepinephrine, acetylcholine and serotonin levels in the brain were found to be significantly reduced in lepa KO fish, while the levels of dopamine, glycine and cortisol in the brain were significantly elevated. In addition, the brain ROS level was elevated, and the anti-oxidative enzyme catalase level was reduced. Taken together, by performing loss-of-function multiple behavior endpoint testing and biochemical analysis, we provide strong evidence for a critical role of lepa gene in modulating anxiety, aggression, fear, and circadian rhythm behaviors in zebrafish for the first time.","fish","末梢脂肪組織から分泌されるホルモンであるレプチンは、動物の食欲を調節します。最近、レプチンは食欲を制御することに加えて、行動反応においても役割を果たすことが証拠によって示されています。この研究では、ゼブラフィッシュモデルの非食欲行動に対するレプチンの潜在的な機能を調べました。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）のゲノム編集ツールを使用することにより、コーディング領域内の4 bpを削除してレプチン（lepa）遺伝子をノックアウトし、早期翻訳停止を作成することに成功しました。形態学的および食欲分析は、lepa KO魚が、食物摂取の制御におけるレプチンの標準的な機能と一致して、肥満、良好な食欲、およびAgouti関連ペプチド（AgRP）とグレリンホルモンの上昇を伴う表現型を示すことを示しました。新規タンク、鏡噛み、捕食者回避、社会的相互作用、浅瀬、概日リズム、および色嗜好アッセイを含む複数の行動エンドポイント分析により、lepa KO魚は、急速な水泳、より少ない凍結時間、より少ない活動を示す不安惹起表現型を示すことがわかりました。捕食者への恐れ、緩い浅瀬領域の形成、概日リズムと色の好みの調節不全。生化学的アッセイを使用して、脳内のメラトニン、ノルエピネフリン、アセチルコリン、およびセロトニンのレベルは、レパKO魚で有意に減少し、脳内のドーパミン、グリシン、およびコルチゾールのレベルは有意に上昇した。さらに、脳のROSレベルが上昇し、抗酸化酵素カタラーゼレベルが低下しました。一緒に取られて、機能喪失複数行動エンドポイントテストと生化学的分析を実行することにより、ゼブラフィッシュの不安、攻撃性、恐怖、および概日リズム行動の調節におけるレパ遺伝子の重要な役割の強力な証拠を初めて提供します。"]
[150,30025131,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","aquaporin 0a; aquaporin 0b","Investigative ophthalmology & visual science","Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.",2018,"59(7):2869-2879","[Vorontsova I et al.]","University of California, Irvine, CA, USA.",30025131,"10.1167/iovs.18-24044 ","Purpose: To investigate the roles of Aquaporin 0a (Aqp0a) and Aqp0b in zebrafish  lens development and transparency. Methods: CRISPR/Cas9 gene editing was used to  generate loss-of-function deletions in zebrafish aqp0a and/or aqp0b. Wild type (WT), single mutant, and double mutant lenses were analyzed from embryonic to adult stages. Lens transparency, morphology, and growth were assessed. Immunohistochemistry was used to map protein localization as well as to assess tissue organization and distribution of cell nuclei. Results: aqp0a-/- and/or aqp0b-/- cause embryonic cataracts with variable penetrance. While lenses of single mutants of either gene recover transparency in juveniles, double mutants consistently form dense cataracts that persist in adults, indicating partially redundant functions. Double mutants also reveal redundant Aqp0 functions in lens  growth. The nucleus of WT lenses moves from the anterior pole to the lens center  with age. In aqp0a-/- mutants, the nucleus fails to centralize as it does in WT or aqp0b-/- lenses, and in double mutant lenses there is no consistent lens nuclear position. In addition, the anterior sutures of aqp0a-/-, but not aqp0b-/- mutants, are unstable resulting in failure of suture maintenance at older stages  and anterior polar opacity. Conclusions. Zebrafish Aqp0s have partially redundant functions, but only Aqp0a promotes suture stability, which directs the lens nucleus to centralize, failure of which results in anterior polar opacity. These  studies support the hypothesis that the two Aqp0s subfunctionalized during fish evolution and that Aqp0-dependent maintenance of the anterior suture is essential for lens transparency.","fish","目的：ゼブラフィッシュの水晶体の発達と透明性におけるアクアポリン0a（Aqp0a）とAqp0bの役割を調査すること。方法：CRISPR / Cas9遺伝子編集を使用して、ゼブラフィッシュaqp0aおよび/またはaqp0bの機能喪失型欠失を生成しました。野生型（WT）、単一変異体、および二重変異体レンズは、胚から成体の段階まで分析されました。レンズの透明度、形態、および成長を評価しました。免疫組織化学を使用して、タンパク質の局在をマッピングし、組織の組織化と細胞核の分布を評価しました。結果：aqp0a-/-および/またはaqp0b-/-は、透過性が変化する胚性白内障を引き起こします。どちらかの遺伝子の単一変異体のレンズは幼体で透明性を回復しますが、二重変異体は一貫して密な白内障を形成し、それは成人で持続し、部分的に冗長な機能を示します。二重変異体はまた、水晶体成長における冗長なAqp0機能を明らかにします。WTレンズの核は、年齢とともに前極からレンズ中心に移動します。aqp0a-/-変異体では、WTまたはaqp0b-/-レンズの場合のように核が集中化できず、二重変異体レンズでは一貫したレンズ核位置がありません。さらに、aqp0a-/-変異体ではなく、aqp0a-/-の前部縫合糸は不安定であり、その結果、より古い段階での縫合糸の維持が失敗し、前部の極性が不透明になります。結論。ゼブラフィッシュAqp0sは部分的に冗長な機能を持っていますが、Aqp0aのみが縫合糸の安定性を促進し、水晶体核を集中化させます。これが失敗すると、前極が不透明になります。これらの研究は、2つのAqp0が魚の進化中に機能不全になり、Aqp0に依存した前部縫合糸の維持がレンズの透明性に不可欠であるという仮説を支持しています。"]
[151,29450543,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","beta subunit of chaperonin containing TCP-1  (cct2)","Investigative ophthalmology & visual science","Mutation in the Zebrafish cct2 Gene Leads to Abnormalities of Cell Cycle and Cell Death in the Retina: A Model of CCT2-Related Leber Congenital Amaurosis.",2018,"59(2):995-1004","[Minegishi Y et al.]","National Eye Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.",29450543,"10.1167/iovs.17-22919 ","Purpose: The compound heterozygous mutations in the beta subunit of chaperonin containing TCP-1 (CCT), encoded by CCT2, lead to the Leber congenital amaurosis (LCA). In this study, a cct2 mutant line of zebrafish was established to investigate the role of CCT2 mutations in LCA in vertebrates. Methods: A cct2 mutant zebrafish line was produced using the CRISPR-Cas9 system. Changes in the eyes of developing wild-type and mutant larvae were monitored using microscopy, immunostaining, TUNEL, and EdU assays. Phenotypic rescue of mutant phenotype was  investigated by injection of CCT2 RNA into zebrafish embryos. Results: The cct2 mutation (L394H-7del) led to the synthesis of a mutated cctbeta protein with the  L394H replacement and deletion of 7 amino acid residues (positions 395-401). The  homozygous cct2-L394H-7del mutant exhibited a small eye phenotype at 2 days post  fertilization (dpf) and was embryonically lethal after 5 dpf. In homozygous cct2-L394H-7del mutants, the retinal ganglion cell differentiation was attenuated, retinal cell cycle was affected, and the neural retinal cell death was significantly increased at 2 dpf compared with wild-type. Injection of RNA encoding wild-type human CCTbeta rescued the small eye phenotype, reduced retinal cell death, and restored the levels of CCTbeta protein and the major client protein Gbeta1 that were significantly reduced in the homozygous cct2-L394H-7del  mutant compared with wild-type. These results indicate that cct2 plays an essential role in retinal development by regulating the cell cycle. Conclusions:  The retinal pathology observed in the homozygous cct2-L394H-7del mutants resembles the retinal pathology of human LCA patients.","fish","目的：CCT2によってコード化されたTCP-1（CCT）を含むシャペロニンのベータサブユニットの複合ヘテロ接合変異は、Leber先天性黒内障（LCA）を引き起こします。この研究では、脊椎動物のLCAにおけるCCT2変異の役割を調査するために、ゼブラフィッシュのcct2変異株が確立されました。方法：cct2変異ゼブラフィッシュ系統はCRISPR-Cas9システムを使用して生産されました。発生中の野生型および突然変異体の幼虫の目の変化を、顕微鏡検査、免疫染色、TUNEL、およびEdUアッセイを使用してモニターしました。変異表現型の表現型レスキューは、ゼブラフィッシュ胚へのCCT2RNAの注入によって調査されました。結果：cct2変異（L394H-7del）は、7つのアミノ酸残基（395-401位）のL394H置換および欠失を伴う変異cctbetaタンパク質の合成をもたらしました。ホモ接合型cct2-L394H-7del変異体は、受精後2日（dpf）に小さな眼の表現型を示し、5dpf後に胚致死性を示しました。ホモ接合型cct2-L394H-7del変異体では、網膜神経節細胞の分化が減弱し、網膜細胞周期が影響を受け、神経網膜細胞死が野生型と比較して2dpfで有意に増加しました。野生型ヒトCCTbetaをコードするRNAの注入は、小さな目の表現型を救い、網膜細胞死を減少させ、野生型と比較してホモ接合型cct2-L394H-7del変異体で有意に減少したCCTbetaタンパク質と主要なクライアントタンパク質Gbeta1のレベルを回復しました。タイプ。これらの結果は、cct2が細胞周期を調節することにより網膜の発達に重要な役割を果たしていることを示しています。結論：ホモ接合型cct2-L394H-7del変異体で観察された網膜病変は、ヒトLCA患者の網膜病変に類似しています。"]
[152,30385710,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","glycine decarboxyla (gldc)","JCI insight","Glycine decarboxylase deficiency-induced motor dysfunction in zebrafish is rescued by counterbalancing glycine synaptic level.",2018,"3(21)","[Riche R et al.]","Universite de Montreal, Montreal, Quebec, Canada.",30385710,"10.1172/jci.insight.124642 ","Glycine encephalopathy (GE), or nonketotic hyperglycinemia (NKH), is a rare recessive genetic disease caused by defective glycine cleavage and characterized  by increased accumulation of glycine in all tissues. Here, based on new case reports of GLDC loss-of-function mutations in GE patients, we aimed to generate a zebrafish model of severe GE in order to unravel the molecular mechanism of the disease. Using CRISPR/Cas9, we knocked out the gldc gene and showed that gldc-/-  fish recapitulate GE on a molecular level and present a motor phenotype reminiscent of severe GE symptoms. The molecular characterization of gldc-/- mutants showed a broad metabolic disturbance affecting amino acids and neurotransmitters other than glycine, with lactic acidosis at stages preceding death. Although a transient imbalance was found in cell proliferation in the brain of gldc-/- zebrafish, the main brain networks were not affected, thus suggesting that GE pathogenicity is mainly due to metabolic defects. We confirmed that the gldc-/- hypotonic phenotype is due to NMDA and glycine receptor overactivation, and demonstrated that gldc-/- larvae depict exacerbated hyperglycinemia at these synapses. Remarkably, we were able to rescue the motor dysfunction of gldc-/- larvae by counterbalancing pharmacologically or genetically the level of glycine at the synapse.","fish","グリシン脳症（GE）、または非ケトン性高グリシン血症（NKH）は、グリシン切断の欠陥によって引き起こされ、すべての組織でのグリシンの蓄積の増加を特徴とするまれな劣性遺伝性疾患です。ここでは、GE患者におけるGLDC機能喪失型変異の新しい症例報告に基づいて、疾患の分子メカニズムを解明するために、重度のGEのゼブラフィッシュモデルを生成することを目的としました。CRISPR / Cas9を使用して、gldc遺伝子をノックアウトし、gldc-/-魚が分子レベルでGEを再現し、重度のGE症状を連想させる運動表現型を示すことを示しました。gldc-/-変異体の分子特性は、グリシン以外のアミノ酸と神経伝達物質に影響を与える広範な代謝障害を示し、死に先立つ段階で乳酸アシドーシスを示した。gldc-/-ゼブラフィッシュの脳の細胞増殖に一過性の不均衡が見られたが、主要な脳ネットワークは影響を受けなかったため、GEの病原性は主に代謝障害によるものであることが示唆された。gldc-/-低張表現型は、NMDAおよびグリシン受容体の過剰活性化によるものであることを確認し、gldc-/-幼虫がこれらのシナプスでの高グリシン血症の悪化を示していることを示しました。驚くべきことに、シナプスでのグリシンのレベルを薬理学的または遺伝的に相殺することにより、gldc-/-幼虫の運動機能障害を救うことができました。"]
[153,30237171,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","transcobalamin homolog (tcn2)","Journal of biological chemistry","Functional and phylogenetic characterization of noncanonical vitamin B12-binding  proteins in zebrafish suggests involvement in cobalamin transport.",2018,"293(45):17606-17621","[Benoit CR et al.]","National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.",30237171,"10.1074/jbc.RA118.005323 ","In humans, transport of food-derived cobalamin (vitamin B12) from the digestive system into the bloodstream involves three paralogous proteins: transcobalamin (TC), haptocorrin (HC), and intrinsic factor (IF). Each of these proteins contains two domains, an alpha-domain and a beta-domain, which together form a cleft in which cobalamin binds. Zebrafish (Danio rerio) are thought to possess only a single cobalamin transport protein, referred to as Tcn2, which is a transcobalamin homolog. Here, we used CRISPR/Cas9 mutagenesis to create null alleles of tcn2 in zebrafish. Fish homozygous for tcn2-null alleles were viable and exhibited no obvious developmentally or behaviorally abnormal phenotypes. For this reason, we hypothesized that previously unidentified cobalamin-carrier proteins encoded in the zebrafish genome may provide an additional pathway for cobalamin transport. We identified genes predicted to code for two such proteins, Tcn-beta-a (Tcnba) and Tcn-beta-b (Tcnbb), which differ from all previously characterized cobalamin transport proteins as they lack the alpha-domain. These beta-domain-only proteins are representative of an undescribed class of cobalamin-carrier proteins that are highly conserved throughout the ray-finned fishes. We observed that the genes encoding the three cobalamin transport homologs, tcn2, tcnba, and tcnbb, are expressed in unique spatial and temporal patterns in the developing zebrafish. Moreover, exogenously expressed recombinant Tcnba and Tcnbb bound cobalamin with high affinity, comparable with binding by full-length Tcn2. Taken together, our results suggest that this noncanonical protein structure has evolved to fully function as a cobalamin-carrier protein, thereby allowing for a compensatory cobalamin transport mechanism in the tcn2 (-/-) zebrafish.","fish","ヒトでは、消化器系から血流への食品由来のコバラミン（ビタミンB12）の輸送には、トランスコバラミン（TC）、ハプトコリン（HC）、および内因性因子（IF）の3つのパラロガスタンパク質が関与します。これらのタンパク質のそれぞれには、アルファドメインとベータドメインの2つのドメインが含まれており、これらが一緒になって、コバラミンが結合する裂け目を形成します。ゼブラフィッシュ（Daniorerio）は、トランスコバラミンホモログであるTcn2と呼ばれる単一のコバラミン輸送タンパク質のみを持っていると考えられています。ここでは、CRISPR / Cas9変異誘発を使用して、ゼブラフィッシュにtcn2のヌル対立遺伝子を作成しました。tcn2-null対立遺伝子についてホモ接合性の魚は生存可能であり、明らかな発達的または行動的に異常な表現型を示さなかった。このため、ゼブラフィッシュのゲノムにコードされているこれまで同定されていなかったコバラミンキャリアタンパク質が、コバラミン輸送のための追加の経路を提供する可能性があると仮定しました。Tcn-beta-a（Tcnba）とTcn-beta-b（Tcnbb）の2つのタンパク質をコードすると予測される遺伝子を特定しました。これらは、アルファドメインがないため、以前に特徴付けられたすべてのコバラミン輸送タンパク質とは異なります。これらのベータドメインのみのタンパク質は、条鰭綱全体で高度に保存されている、説明されていないクラスのコバラミンキャリアタンパク質の代表です。3つのコバラミン輸送ホモログ、tcn2、tcnba、およびtcnbbをコードする遺伝子が、発達中のゼブラフィッシュにおいて独特の空間的および時間的パターンで発現されることを観察しました。さらに、外因的に発現された組換えTcnbaおよびTcnbbは、完全長Tcn2による結合に匹敵する高い親和性でコバラミンに結合しました。まとめると、我々の結果は、この非標準的なタンパク質構造が進化してコバラミン担体タンパク質として完全に機能し、それによってtcn2（-/-）ゼブラフィッシュにおける代償性コバラミン輸送メカニズムを可能にしたことを示唆している。"]
[154,30126845,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","factor inhibiting HIF (FIH)","Journal of biological chemistry","Deletion of the fih gene encoding an inhibitor of hypoxia-inducible factors increases hypoxia tolerance in zebrafish.",2018,"293(40):15370-15380","[Cai X et al.]","Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China",30126845,"10.1074/jbc.RA118.003004 ","Many aerobic organisms have developed molecular mechanism to tolerate hypoxia, but the specifics of these mechanisms remain poorly understood. It is important to develop genetic methods that confer increased hypoxia tolerance to intensively farmed aquatic species, as these are maintained in environments with limited available oxygen. As an asparaginyl hydroxylase of hypoxia-inducible factors (HIFs), factor inhibiting HIF (FIH) inhibits transcriptional activation of hypoxia-inducible genes by blocking the association of HIFs with the transcriptional coactivators CREB-binding protein (CBP) and p300. Therefore, here we sought to test whether fih is involved in regulating hypoxia tolerance in the  commonly used zebrafish model. Overexpressing the zebrafish fih gene in epithelioma papulosum cyprini (EPC) cells and embryos, we found that fih inhibits the transcriptional activation of zebrafish HIF-alpha proteins. Using CRISPR/Cas9 to obtain fih-null zebrafish mutants, we noted that the fih deletion makes zebrafish more tolerant of hypoxic conditions than their WT siblings, but does not result in oxygen consumption rates that significantly differ from those of WT fish. Of note, we identified fewer apoptotic cells in adult fih-null zebrafish brains and in fih-null embryos, possibly explaining why the fih-null mutant had greater hypoxia tolerance than the WT. Moreover, the fih deletion up-regulated several hypoxia-inducible genes in fih-null zebrafish exposed to hypoxia. The findings of our study suggest that fih plays a role in hypoxia tolerance by affecting the rate of cellular apoptosis in zebrafish.","fish","多くの好気性生物は低酸素症に耐える分子メカニズムを開発しましたが、これらのメカニズムの詳細はよくわかっていません。これらは限られた利用可能な酸素のある環境で維持されるため、集中的に養殖された水生種に低酸素耐性の増加を与える遺伝的方法を開発することが重要です。低酸素誘導因子（HIF）のアスパラギニルヒドロキシラーゼとして、HIFを阻害する因子（FIH）は、HIFと転写共活性化因子CREB結合タンパク質（CBP）およびp300との結合をブロックすることにより、低酸素誘導遺伝子の転写活性化を阻害します。したがって、ここでは、一般的に使用されるゼブラフィッシュモデルでfihが低酸素耐性の調節に関与しているかどうかをテストしようとしました。ゼブラフィッシュfih遺伝子を上皮腫papulosumcyprini（EPC）細胞および胚で過剰発現させると、fihがゼブラフィッシュHIF-alphaタンパク質の転写活性化を阻害することがわかりました。CRISPR / Cas9を使用してfih-nullゼブラフィッシュ変異体を取得し、fihの削除により、ゼブラフィッシュはWT兄弟よりも低酸素状態に対して耐性が高くなりますが、WT魚と大幅に異なる酸素消費率は得られないことに気付きました。注目すべきことに、我々は成体のfih-nullゼブラフィッシュの脳とfih-null胚でアポトーシス細胞が少ないことを確認しました。これは、fih-null変異体がWTよりも低酸素耐性が高い理由を説明している可能性があります。さらに、fih欠失は、低酸素にさらされたfihnullゼブラフィッシュのいくつかの低酸素誘導性遺伝子をアップレギュレートしました。私たちの研究の結果は、fihがゼブラフィッシュの細胞アポトーシスの速度に影響を与えることによって低酸素耐性に役割を果たすことを示唆しています。"]
[155,29500194,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Y box-binding protein 1","Journal of biological chemistry","An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing.",2018,"293(17):6611-6622","[Zhang Y et al.]","University of Macau, Macau, China.",29500194,"10.1074/jbc.RA117.001080 ","Homology-directed recombination (HDR)-mediated genome editing is a powerful approach for both basic functional study and disease modeling. Although some studies have reported HDR-mediated precise editing in nonrodent models, the efficiency of establishing pure mutant animal lines that carry specific amino acid substitutions remains low. Furthermore, because the efficiency of nonhomologous end joining (NHEJ)-induced insertion and deletion (indel) mutations is normally much higher than that of HDR-induced point mutations, it is often difficult to identify the latter in the background of indel mutations. Using zebrafish as the model organism and Y box-binding protein 1 (Ybx1/ybx1) as the model molecule, we have established an efficient platform for precise CRISPR/Cas9-mediated gene editing in somatic cells, yielding an efficiency of up  to 74% embryos. Moreover, we established a procedure for screening germline transmission of point mutations out of indel mutations even when germline transmission efficiency was low (<2%). To further improve germline transmission of HDR-induced point mutations, we optimized several key factors that may affect  HDR efficiency, including the type of DNA donor, suppression of NHEJ, stimulation of HDR pathways, and use of Cas9 protein instead of mRNA. The optimized combination of these factors significantly increased the efficiency of germline transmission of point mutation up to 25%. In summary, we have developed an efficient procedure for creating point mutations and differentiating mutant individuals from those carrying knockouts of entire genes.","fish","相同性指向組換え（HDR）を介したゲノム編集は、基本的な機能研究と疾患モデリングの両方にとって強力なアプローチです。一部の研究では、非げっ歯類モデルでのHDRを介した正確な編集が報告されていますが、特定のアミノ酸置換を持つ純粋な変異動物系統を確立する効率は低いままです。さらに、非相同末端結合（NHEJ）によって誘発される挿入および削除（indel）突然変異の効率は、通常、HDRによって誘発される点突然変異の効率よりもはるかに高いため、インデル突然変異の背景で後者を特定することはしばしば困難です。モデル生物としてゼブラフィッシュを使用し、モデル分子としてYボックス結合タンパク質1（Ybx1 / ybx1）を使用して、体細胞における正確なCRISPR / Cas9を介した遺伝子編集のための効率的なプラットフォームを確立し、最大74％の効率を実現しました。胚。さらに、生殖細胞系列の伝達効率が低い（<2％）場合でも、インデル突然変異から点突然変異の生殖細胞系列伝達をスクリーニングする手順を確立しました。HDR誘発点突然変異の生殖細胞系列伝達をさらに改善するために、DNAドナーのタイプ、NHEJの抑制、HDR経路の刺激、mRNAの代わりにCas9タンパク質の使用など、HDR効率に影響を与える可能性のあるいくつかの重要な要因を最適化しました。これらの要因の最適化された組み合わせにより、点突然変異の生殖細胞系伝達の効率が最大25％大幅に向上しました。要約すると、点突然変異を作成し、突然変異個体を遺伝子全体のノックアウトを持つ個体と区別するための効率的な手順を開発しました。"]
[156,29162721,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","alphaB-crystallin (alphaBa; alphaBb)","Journal of biological chemistry","Loss of alphaB-crystallin function in zebrafish reveals critical roles in the development of the lens and stress resistance of the heart.",2018,"293(2):740-753","[Mishra S et al.]","Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, TN, USA.",29162721,"10.1074/jbc.M117.808634 ","Genetic mutations in the human small heat shock protein alphaB-crystallin have been implicated in autosomal cataracts and skeletal myopathies, including heart muscle diseases (cardiomyopathy). Although these mutations lead to modulation of  their chaperone activity in vitro, the in vivo functions of alphaB-crystallin in  the maintenance of both lens transparency and muscle integrity remain unclear. This lack of information has hindered a mechanistic understanding of these diseases. To better define the functional roles of alphaB-crystallin, we generated loss-of-function zebrafish mutant lines by utilizing the CRISPR/Cas9 system to specifically disrupt the two alphaB-crystallin genes, alphaBa and alphaBb We observed lens abnormalities in the mutant lines of both genes, and the penetrance of the lens phenotype was higher in alphaBa than alphaBb mutants. This finding is in contrast with the lack of a phenotype previously reported in alphaB-crystallin knock-out mice and suggests that the elevated chaperone activity of the two zebrafish orthologs is critical for lens development. Besides its key role in the lens, we uncovered another critical role for alphaB-crystallin in providing stress tolerance to the heart. The alphaB-crystallin mutants exhibited hypersusceptibility to develop pericardial edema when challenged by crowding stress or exposed to elevated cortisol stress,  both of which activate glucocorticoid receptor signaling. Our work illuminates the involvement of alphaB-crystallin in stress tolerance of the heart presumably  through the proteostasis network and reinforces the critical role of the chaperone activity of alphaB-crystallin in the maintenance of lens transparency.","fish","ヒトの小さな熱ショックタンパク質alphaB-crystallinの遺伝的変異は、常染色体白内障および心筋疾患（心筋症）を含む骨格筋障害に関係している。これらの変異はinvitroでのシャペロン活性の調節につながりますが、レンズの透明性と筋肉の完全性の両方の維持におけるalphaB-crystallinのinvivo機能は不明なままです。この情報の欠如は、これらの病気の機械的な理解を妨げてきました。alphaB-クリスタリンの機能的役割をより明確に定義するために、CRISPR / Cas9システムを利用して2つのalphaB-クリスタリン遺伝子、alphaBaとalphaBbを特異的に破壊することにより、機能喪失ゼブラフィッシュ変異株を生成しました。両方の遺伝子、およびレンズ表現型の浸透度は、alphaBb変異体よりもalphaBaで高かった。この発見は、alphaB-クリスタリンノックアウトマウスで以前に報告された表現型の欠如とは対照的であり、2つのゼブラフィッシュオルソログのシャペロン活性の上昇が水晶体の発達に重要であることを示唆しています。レンズにおけるその重要な役割に加えて、心臓にストレス耐性を提供する上でのalphaB-クリスタリンの別の重要な役割を明らかにしました。alphaB-クリスタリン変異体は、混雑ストレスにさらされたり、コルチゾールストレスの上昇にさらされたりすると、心膜浮腫を発症する感受性が高くなり、どちらも糖質コルチコイド受容体シグナル伝達を活性化します。私たちの仕事は、おそらくタンパク質恒常性ネットワークを介して心臓のストレス耐性におけるアルファB-クリスタリンの関与を明らかにし、レンズの透明性の維持におけるアルファB-クリスタリンのシャペロン活性の重要な役割を強化します。"]
[157,30179222,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","nup107; nup85","Journal of clinical investigation","Mutations in multiple components of the nuclear pore complex cause nephrotic syndrome.",2018,"128(10):4313-4328","[Braun DA et al.]","Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA.",30179222,"10.1172/JCI98688 ","Steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS) almost invariably progresses to end-stage renal disease. Although more than 50 monogenic causes of SRNS have been described, a large proportion of SRNS remains unexplained. Recently, it was discovered that mutations of NUP93 and NUP205, encoding 2 proteins of the inner ring subunit of the nuclear pore complex (NPC), cause SRNS. Here, we describe mutations in genes encoding 4 components of the outer rings of the NPC, namely NUP107, NUP85, NUP133, and NUP160, in 13 families with SRNS. Using coimmunoprecipitation experiments, we showed that certain pathogenic alleles weakened the interaction between neighboring NPC subunits. We demonstrated that morpholino knockdown of nup107, nup85, or nup133 in Xenopus disrupted glomerulogenesis. Re-expression of WT mRNA, but not of mRNA reflecting mutations  from SRNS patients, mitigated this phenotype. We furthermore found that CRISPR/Cas9 knockout of NUP107, NUP85, or NUP133 in podocytes activated Cdc42, an important effector of SRNS pathogenesis. CRISPR/Cas9 knockout of nup107 or nup85  in zebrafish caused developmental anomalies and early lethality. In contrast, an  in-frame mutation of nup107 did not affect survival, thus mimicking the allelic effects seen in humans. In conclusion, we discovered here that mutations in 4 genes encoding components of the outer ring subunits of the NPC cause SRNS and thereby provide further evidence that specific hypomorphic mutations in these essential genes cause a distinct, organ-specific phenotype.","fish","ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群（SRNS）は、ほぼ必ず末期腎疾患に進行します。SRNSの50以上の単一遺伝子の原因が説明されていますが、SRNSの大部分は説明されていないままです。最近、核細孔複合体（NPC）の内輪サブユニットの2つのタンパク質をコードするNUP93およびNUP205の変異がSRNSを引き起こすことが発見されました。ここでは、SRNSを使用する13のファミリで、NPCの外輪の4つのコンポーネント、つまりNUP107、NUP85、NUP133、およびNUP160をコードする遺伝子の変異について説明します。共免疫沈降実験を使用して、特定の病原性対立遺伝子が隣接するNPCサブユニット間の相互作用を弱めることを示しました。Xenopusでのnup107、nup85、またはnup133のモルホリノノックダウンが糸球体形成を破壊することを示しました。SRNS患者からの突然変異を反映するmRNAではなくWTmRNAの再発現は、この表現型を軽減しました。さらに、ポドサイトにおけるNUP107、NUP85、またはNUP133のCRISPR / Cas9ノックアウトが、SRNS病因の重要なエフェクターであるCdc42を活性化することを発見しました。ゼブラフィッシュにおけるnup107またはnup85のCRISPR / Cas9ノックアウトは、発達異常と早期致死を引き起こしました。対照的に、nup107のフレーム内変異は生存に影響を与えなかったため、人間に見られる対立効果を模倣しました。結論として、NPCの外輪サブユニットの構成要素をコードする4つの遺伝子の変異がSRNSを引き起こし、それによってこれらの必須遺伝子の特定の低形態変異が明確な器官特異的表現型を引き起こすというさらなる証拠を提供することをここで発見しました。"]
[158,30070695,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","norepinephrine transporter gene (slc6a2)","Journal of comparative neurology","Features of the structure, development, and activity of the zebrafish noradrenergic system explored in new CRISPR transgenic lines.",2018,"526(15):2493-2508","[Farrar MJ  et al.]","Cornell University, Ithaca, NY, USA.",30070695,"10.1002/cne.24508 ","The noradrenergic (NA) system of vertebrates is implicated in learning, memory, arousal, and neuroinflammatory responses, but is difficult to access experimentally. Small and optically transparent, larval zebrafish offer the prospect of exploration of NA structure and function in an intact animal. We made multiple transgenic zebrafish lines using the CRISPR/Cas9 system to insert fluorescent reporters upstream of slc6a2, the norepinephrine transporter gene. These lines faithfully express reporters in NA cell populations, including the locus coeruleus (LC), which contains only about 14 total neurons. We used the lines in combination with two-photon microscopy to explore the structure and projections of the NA system in the context of the columnar organization of cell  types in the zebrafish hindbrain. We found robust alignment of NA projections with glutamatergic neurotransmitter stripes in some hindbrain segments, suggesting orderly relations to neuronal cell types early in life. We also quantified neurite density in the rostral spinal cord in individual larvae with as much as 100% difference in the number of LC neurons, and found no correlation  between neuronal number in the LC and projection density in the rostral spinal cord. Finally, using light sheet microscopy, we performed bilateral calcium imaging of the entire LC. We found that large-amplitude calcium responses were evident in all LC neurons and showed bilateral synchrony, whereas small-amplitude events were more likely to show interhemispheric asynchrony, supporting the potential for targeted LC neuromodulation. Our observations and new transgenic lines set the stage for a deeper understanding of the NA system.","fish","脊椎動物のノルアドレナリン作動性（NA）システムは、学習、記憶、覚醒、および神経炎症反応に関係していますが、実験的にアクセスすることは困難です。小さくて光学的に透明な幼虫のゼブラフィッシュは、無傷の動物のNAの構造と機能を探求する可能性を提供します。CRISPR / Cas9システムを使用して複数のトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を作成し、ノルエピネフリントランスポーター遺伝子であるslc6a2の上流に蛍光レポーターを挿入しました。これらの系統は、合計約14個のニューロンしか含まない遺伝子座coeruleus（LC）を含むNA細胞集団のレポーターを忠実に表現します。線を2光子顕微鏡と組み合わせて使用​​し、ゼブラフィッシュ後脳の細胞型の柱状組織の文脈でNAシステムの構造と投影を調査しました。いくつかの後脳セグメントで、NAプロジェクションとグルタミン酸作動性神経伝達物質ストライプとの強固なアラインメントが見られ、人生の早い段階で神経細胞タイプとの秩序ある関係が示唆されました。また、個々の幼虫の吻側脊髄の神経突起密度を定量化し、LCニューロンの数に100％もの違いがあり、LCのニューロン数と吻側脊髄の投射密度の間に相関関係は見られませんでした。最後に、ライトシート顕微鏡を使用して、LC全体の両側カルシウムイメージングを実行しました。大振幅のカルシウム応答はすべてのLCニューロンで明らかであり、両側の同期を示したが、小振幅のイベントは半球間非同期を示す可能性が高く、標的LC神経調節の可能性を裏付けていることがわかった。私たちの観察と新しいトランスジェニック系統は、NAシステムをより深く理解するための準備を整えました。"]
[159,30555080,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Nodal-related protein (ndr2)","Journal of genetics","Analysis of novel domain-specific mutations in the zebrafish ndr2/cyclops gene generated using CRISPR-Cas9 RNPs.",2018,"97(5):1315-1325. ","[Turner AN et al.]","University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA.",30555080,"10.1007/s12041-018-1033-6","Nodal-related protein (ndr2) is amember of the transforming growth factor type beta superfamily of factors and is required for ventral midline patterning of the embryonic central nervous system in zebrafish. In humans, mutations in the gene encoding nodal cause holoprosencephaly and heterotaxy. Mutations in the ndr2 gene in the zebrafish (Danio rerio) lead to similar phenotypes, including loss of the  medial floor plate, severe deficits in ventral forebrain development and cyclopia. Alleles of the ndr2 gene have been useful in studying patterning of ventral structures of the central nervous system. Fifteen different ndr2 alleles  have been reported in zebrafish, of which eight were generated using chemical mutagenesis, four were radiation-induced and the remaining alleles were obtained  via random insertion, gene targeting (TALEN) or unknown methods. Therefore, most  mutation sites were random and could not be predicted a priori. Using the CRISPR-Cas9 system from Streptococcus pyogenes, we targeted distinct regions in all three exons of zebrafish ndr2 and observed cyclopia in the injected (G0) embryos.We show that the use of sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes can  cause penetrant cyclopic phenotypes in injected (G0) embryos. Targeted polymerase chain reaction amplicon analysis using Sanger sequencing showed that most of the  alleles had small indels resulting in frameshifts. The sequence information correlates with the loss of ndr2 activity. In this study, we validate multiple CRISPR targets using an in vitro nuclease assay and in vivo analysis using embryos. We describe one specific mutant allele resulting in the loss of conserved terminal cysteine-coding sequences. This study is another demonstration of the utility of the CRISPR-Cas9 system in generating domain-specific mutations  and provides further insights into the structure-function of the ndr2 gene.","fish","節関連タンパク質（ndr2）は、形質転換成長因子型ベータスーパーファミリーの因子のメンバーであり、ゼブラフィッシュの胚性中枢神経系の腹側正中線パターン形成に必要です。ヒトでは、リンパ節をコードする遺伝子の突然変異は、全前脳症と異所性を引き起こします。ゼブラフィッシュ（Daniorerio）のndr2遺伝子の変異は、内側床板の喪失、腹側前脳発達の重度の欠損、シクロピアなど、同様の表現型をもたらします。ndr2遺伝子の対立遺伝子は、中枢神経系の腹側構造のパターン形成を研究するのに役立ちました。ゼブラフィッシュでは15の異なるndr2対立遺伝子が報告されており、そのうち8つは化学突然変異誘発を使用して生成され、4つは放射線誘発性であり、残りの対立遺伝子はランダム挿入、遺伝子ターゲティング（TALEN）、または未知の方法で取得されました。したがって、ほとんどの突然変異部位はランダムであり、事前に予測することはできませんでした。Streptococcus pyogenesのCRISPR-Cas9システムを使用して、ゼブラフィッシュndr2の3つのエキソンすべての異なる領域をターゲットにし、注入された（G0）胚で単眼症を観察しました.sgRNA-Cas9リボヌクレオプロテイン（RNP）複合体の使用が浸透性単眼症を引き起こす可能性があることを示します注入された（G0）胚の表現型。サンガーシーケンシングを使用したターゲットポリメラーゼ連鎖反応アンプリコン分析は、ほとんどの対立遺伝子が小さなインデルを持ち、フレームシフトをもたらすことを示しました。シーケンス情報は、ndr2アクティビティの喪失と相関しています。この研究では、invitroヌクレアーゼアッセイと胚を使用したinvivo分析を使用して、複数のCRISPRターゲットを検証します。保存された末端システインコード配列の喪失をもたらす1つの特定の変異対立遺伝子について説明します。この研究は、ドメイン固有の変異の生成におけるCRISPR-Cas9システムの有用性の別のデモンストレーションであり、ndr2遺伝子の構造機能へのさらなる洞察を提供します。"]
[160,28913702,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","galactose-1-phosphate uridylyltransferase","Journal of inherited metabolic disease","Impaired fertility and motor function in a zebrafish model for classic galactosemia.",2018,"41(1):117-127","[Vanoevelen JM et al.]","Maastricht University Medical Centre, Maastricht, The Netherlands.",28913702,"10.1007/s10545-017-0071-1 ","Classic galactosemia is a genetic disorder of galactose metabolism, caused by severe deficiency of galactose-1-phosphate uridylyltransferase (GALT) enzyme activity due to mutations of the GALT gene. Its pathogenesis is still not fully elucidated, and a therapy that prevents chronic impairments is lacking. In order  to move research forward, there is a high need for a novel animal model, which allows organ studies throughout development and high-throughput screening of pharmacologic compounds. Here, we describe the generation of a galt knockout zebrafish model and present its phenotypical characterization. Using a TALEN approach, a galt knockout line was successfully created. Accordingly, biochemical assays confirm essentially undetectable galt enzyme activity in homozygotes. Analogous to humans, galt knockout fish accumulate galactose-1-phosphate upon exposure to exogenous galactose. Furthermore, without prior exposure to exogenous galactose, they exhibit reduced motor activity and impaired fertility (lower egg  quantity per mating, higher number of unsuccessful crossings), resembling the human phenotype(s) of neurological sequelae and subfertility. In conclusion, our  galt knockout zebrafish model for classic galactosemia mimics the human phenotype(s) at biochemical and clinical levels. Future studies in our model will contribute to improved understanding and management of this disorder.","fish","古典的なガラクトース血症は、GALT遺伝子の変異によるガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（GALT）酵素活性の深刻な欠乏によって引き起こされるガラクトース代謝の遺伝的障害です。その病因はまだ完全には解明されておらず、慢性的な機能障害を予防する治療法が不足しています。研究を前進させるためには、薬理学的化合物の開発およびハイスループットスクリーニング全体にわたる臓器研究を可能にする新しい動物モデルの必要性が高い。ここでは、ゴールトノックアウトゼブラフィッシュモデルの生成について説明し、その表現型の特性を示します。TALENアプローチを使用して、ゴールトノックアウトラインが正常に作成されました。したがって、生化学的アッセイは、ホモ接合体において本質的に検出不可能なゴールト酵素活性を確認する。人間と同様に、ゴールトノックアウト魚は外因性ガラクトースにさらされるとガラクトース-1-リン酸を蓄積します。さらに、外因性ガラクトースへの事前の曝露がなければ、それらは運動活動の低下と生殖能力の低下（交配あたりの卵数の減少、交配の失敗の数の増加）を示し、神経学的後遺症と生殖能力の低下の人間の表現型に似ています。結論として、古典的なガラクトース血症の私たちのゴールトノックアウトゼブラフィッシュモデルは、生化学的および臨床レベルで人間の表現型を模倣しています。私たちのモデルの将来の研究は、この障害の理解と管理の改善に貢献するでしょう。"]
[161,30030150,"animal\n(fish)","zebrafish","Cas9;","abcc6a","Journal of investigative dermatology","Generation and Validation of a Complete Knockout Model of abcc6a in Zebrafish.",2018,"138(11):2333-2342","[Van Gils M et al.]","Ghent University Hospital, Ghent, Belgium.",30030150,"10.1016/j.jid.2018.06.183 ","Pseudoxanthoma elasticum is an ectopic mineralization disease due to biallelic ABCC6 mutations. As no treatment options are currently available, a reliable zebrafish model is invaluable for high throughput compound screening. However, data from previously reported knockdown and mutant zebrafish models for abcc6a, the functional orthologue of ABCC6, showed phenotypic discrepancies. To address this, we developed a complete abcc6a knockout model using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 and compared its phenotype to that of  a mutant model (Sa963) and a splice junction morpholino model. Our data showed that abcc6a is not required for embryonic survival, but rather that it has an essential role in controlling mineralization. The three models developed very similar hypermineralization of spine and ribs starting embryonically and progressing in adulthood with development of scoliosis. Our results indicate a direct relation between loss of abcc6a expression and dysregulated osteogenesis.  As such, our models recapitulate part of the human phenotype in which ectopic mineralization and pro-osteogenic signaling have been reported. Because of its reproducibility in three models and its ease of quantification, we consider this  phenotype to be unequivocally the result of abcc6 deficiency and, as such, an excellent readout for drug screening purposes and multiplex mutagene analysis.","fish","Pseudoxanthoma elasticumは、2対立遺伝子のABCC6変異による異所性石灰化疾患です。現在利用できる治療オプションがないため、信頼性の高いゼブラフィッシュモデルは、ハイスループット化合物のスクリーニングに非常に役立ちます。ただし、ABCC6の機能的オルソログであるabcc6aの以前に報告されたノックダウンおよび変異ゼブラフィッシュモデルからのデータは、表現型の不一致を示しました。これに対処するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ Cas9を使用して完全なabcc6aノックアウトモデルを開発し、その表現型を変異モデル（Sa963）およびスプライスジャンクションモルホリノモデルの表現型と比較しました。私たちのデータは、abcc6aが胚の生存に必要ではなく、鉱化作用の制御に不可欠な役割を果たしていることを示しています。3つのモデルは、脊椎と肋骨の非常に類似した高ミネラル化を発症し、胎児期に始まり、成人期に脊柱側弯症の発症とともに進行しました。我々の結果は、abcc6a発現の喪失と調節不全の骨形成との直接的な関係を示しています。このように、私たちのモデルは、異所性石灰化と骨形成促進シグナル伝達が報告されているヒトの表現型の一部を要約しています。3つのモデルでの再現性と定量化の容易さから、この表現型はabcc6欠損の結果であることが明確であり、薬物スクリーニングや多重変異原性分析のための優れた読み出しであると考えられます。"]
[162,29174768,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","histone acetyltransferase (kat2a; kat2b)","Journal of molecular and cellular cardiology","Acetylation of TBX5 by KAT2B and KAT2A regulates heart and limb development.",2018,"114:185-198","[Ghosh TK et al.]","University of Nottingham, Nottingham, UK.",29174768,"10.1016/j.yjmcc.2017.11.013 ","TBX5 plays a critical role in heart and forelimb development. Mutations in TBX5 cause Holt-Oram syndrome, an autosomal dominant condition that affects the formation of the heart and upper-limb. Several studies have provided significant  insight into the role of TBX5 in cardiogenesis; however, how TBX5 activity is regulated by other factors is still unknown. Here we report that histone acetyltransferases KAT2A and KAT2B associate with TBX5 and acetylate it at Lys339. Acetylation potentiates its transcriptional activity and is required for  nuclear retention. Morpholino-mediated knockdown of kat2a and kat2b transcripts in zebrafish severely perturb heart and limb development, mirroring the tbx5a knockdown phenotype. The phenotypes found in MO-injected embryos were also observed when we introduced mutations in the kat2a or kat2b genes using the CRISPR-Cas system. These studies highlight the importance of KAT2A and KAT2B modulation of TBX5 and their impact on heart and limb development.","fish","TBX5は、心臓と前肢の発達に重要な役割を果たします。TBX5の変異は、心臓と上肢の形成に影響を与える常染色体優性疾患であるホルトオーラム症候群を引き起こします。いくつかの研究は、心臓発生におけるTBX5の役割についての重要な洞察を提供しています。ただし、TBX5の活動が他の要因によってどのように調節されているかはまだ不明です。ここでは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼKAT2AおよびKAT2BがTBX5と結合し、Lys339でアセチル化することを報告します。アセチル化はその転写活性を増強し、核の保持に必要です。ゼブラフィッシュにおけるkat2aおよびkat2b転写産物のモルフォリノ媒介ノックダウンは、tbx5aノックダウン表現型を反映して、心臓および四肢の発達をひどく混乱させます。MOを注入した胚に見られる表現型は、CRISPR-Casシステムを使用してkat2aまたはkat2b遺伝子に変異を導入したときにも観察されました。これらの研究は、TBX5のKAT2AおよびKAT2B変調の重要性と、心臓および四肢の発達に対するそれらの影響を強調しています。"]
[163,30060229,"animal\n(fish)","zebrafish","Cas9;","ntla; gata5","Journal of molecular cell biology","The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.",2018,"10(6):479-493","[Wu X et al.]","Tsinghua University, Beijing, China.",30060229,"10.1093/jmcb/mjy044 ","Oocytes, the irreplaceable gametes for generating a new organism, are matured in  the ovary of living female animals. It is unknown whether any genetic manipulations can be applied to immature oocytes inside the living ovaries. As a  proof-of-concept, we here demonstrate genetic amendments of zebrafish immature oocytes within the ovary. Oocyte microinjection in situ (OMIS) stimulates tissue  repair responses, but some of the microinjected immature oocytes are matured, ovulated and fertilizable. By OMIS-mediated Cas9 approach, ntla and gata5 loci of oocytes arrested at prophase I of meiosis are successfully edited before fertilization. Through OMIS, high efficiency of biallelic mutations in single or  multiple loci using Cas9/gRNAs allows immediate manifestation of mutant phenotypes in F0 embryos and multiple transgenes can co-express the reporters in  F0 embryos with patterns similar to germline transgenic embryos. Furthermore, maternal knockdown of dnmt1 by antisense morpholino via OMIS results in a dramatic decrease of global DNA methylation level at the dome stage and causes embryonic lethality prior to segmentation period. Therefore, OMIS opens a door to efficiently modify the genome and provides a possibility to repair genetically abnormal oocytes in situ.","fish","新しい生物を生み出すためのかけがえのない配偶子である卵母細胞は、生きている雌の動物の卵巣で成熟します。生きている卵巣内の未成熟卵母細胞に遺伝子操作を適用できるかどうかは不明です。概念実証として、ここでは、卵巣内のゼブラフィッシュの未成熟卵母細胞の遺伝的修正を示します。インサイチュでの卵母細胞マイクロインジェクション（OMIS）は組織修復反応を刺激しますが、マイクロインジェクションされた未成熟卵母細胞のいくつかは成熟し、排卵し、受精可能です。OMISを介したCas9アプローチにより、減数分裂の前期Iで停止した卵母細胞のntlaおよびgata5遺伝子座は、受精前に正常に編集されます。OMISを介して、Cas9 / gRNAを使用した単一または複数の遺伝子座での二対立遺伝子変異の高効率により、F0胚での変異表現型の即時発現が可能になり、複数のトランスジーンが生殖系列トランスジェニック胚と同様のパターンでF0胚でレポーターを共発現できます。さらに、OMISを介したアンチセンスモルホリノによるdnmt1の母体ノックダウンは、ドーム段階でのグローバルDNAメチル化レベルの劇的な減少をもたらし、セグメンテーション期間の前に胚の致死性を引き起こします。したがって、OMISはゲノムを効率的に改変するための扉を開き、遺伝的に異常な卵母細胞をその場で修復する可能性を提供します。"]
[164,29793976,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","NADPH oxidase (nox1, nox2/cybb, nox5, duox)","Journal of neuroscience","nox2/cybb Deficiency Affects Zebrafish Retinotectal Connectivity.",2018,"38(26):5854-5871","[Weaver CJ  et al.]","Purdue University, West Lafayette, IN, USA.",29793976,"10.1523/JNEUROSCI.1483-16.2018 ","NADPH oxidase (Nox)-derived reactive oxygen species (ROS) have been linked to neuronal polarity, axonal outgrowth, cerebellar development, regeneration of sensory axons, and neuroplasticity. However, the specific roles that individual Nox isoforms play during nervous system development in vivo remain unclear. To address this problem, we investigated the role of Nox activity in the development of retinotectal connections in zebrafish embryos. Zebrafish broadly express four  nox genes (nox1, nox2/cybb, nox5, and duox) throughout the CNS during early development. Application of a pan-Nox inhibitor, celastrol, during the time of optic nerve (ON) outgrowth resulted in significant expansion of the ganglion cell layer (GCL), thinning of the ON, and a decrease in retinal axons reaching the optic tectum (OT). With the exception of GCL expansion, these effects were partially ameliorated by the addition of H2O2, a key ROS involved in Nox signaling. To address isoform-specific Nox functions, we used CRISPR/Cas9 to generate mutations in each zebrafish nox gene. We found that nox2/cybb chimeric mutants displayed ON thinning and decreased OT innervation. Furthermore, nox2/cybb homozygous mutants (nox2/cybb(-/-)) showed significant GCL expansion and mistargeted retinal axons in the OT. Neurite outgrowth from cultured zebrafish retinal ganglion cells was reduced by Nox inhibitors, suggesting a cell-autonomous role for Nox in these neurons. Collectively, our results show that Nox2/Cybb is important for retinotectal development in zebrafish.SIGNIFICANCE STATEMENT Most isoforms of NADPH oxidase (Nox) only produce reactive oxygen species (ROS) when activated by an upstream signal, making them ideal candidates for ROS signaling. Nox enzymes are present in neurons and their activity has been shown to be important for neuronal development and function largely by in vitro studies. However, whether Nox is involved in the development of axons and formation of neuronal connections in vivo has remained unclear. Using mutant zebrafish embryos, this study shows that  a specific Nox isoform, Nox2/Cybb, is important for the establishment of axonal connections between retinal ganglion cells and the optic tectum.","fish","NADPHオキシダーゼ（Nox）由来の活性酸素種（ROS）は、ニューロンの極性、軸索の伸長、小脳の発達、感覚軸索の再生、および神経可塑性に関連しています。ただし、個々のNoxアイソフォームがinvivoでの神経系発生中に果たす特定の役割は不明なままです。この問題に対処するために、ゼブラフィッシュ胚の網膜直腸接続の発達におけるNox活性の役割を調査しました。ゼブラフィッシュは、初期の発達中に中枢神経系全体で4つのnox遺伝子（nox1、nox2 / cybb、nox5、およびduox）を広く発現します。視神経（ON）の成長時に汎Nox阻害剤であるセラストロールを適用すると、神経節細胞層（GCL）が大幅に拡大し、ONが薄くなり、視蓋（OT）に到達する網膜軸が減少しました。 ）。GCLの拡張を除いて、これらの影響は、Noxシグナリングに関与する主要なROSであるH2O2の追加によって部分的に改善されました。アイソフォーム固有のNox機能に対処するために、CRISPR / Cas9を使用して各ゼブラフィッシュnox遺伝子に変異を生成しました。我々は、nox2 / cybbキメラ変異体が間伐を示し、OT神経支配を減少させることを発見した。さらに、nox2 / cybbホモ接合変異体（nox2 / cybb（-/-））は、OTで有意なGCL拡張と誤って標的化された網膜軸索を示した。培養ゼブラフィッシュ網膜神経節細胞からの神経突起伸長は、Nox阻害剤によって減少し、これらのニューロンにおけるNoxの細胞自律的役割を示唆しています。まとめると、我々の結果は、Nox2 / Cybbがゼブラフィッシュの網膜直腸の発達に重要であることを示しています。重要なステートメントNADPHオキシダーゼ（Nox）のほとんどのアイソフォームは、上流のシグナルによって活性化された場合にのみ活性酸素種（ROS）を生成し、ROSシグナル伝達の理想的な候補になります。Nox酵素はニューロンに存在し、それらの活性はニューロンの発達に重要であり、主にinvitro研究によって機能することが示されています。しかし、Noxがinvivoでの軸索の発達と神経接続の形成に関与しているかどうかは不明なままです。変異ゼブラフィッシュ胚を使用して、この研究は、特定のNoxアイソフォームであるNox2 / Cybbが、網膜神経節細胞と視蓋の間の軸索接続の確立に重要であることを示しています。"]
[165,30222157,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;"," ","Journal of visualized experiments : JoVE","Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio.",2018,"(138)","[Sorlien EL et al.]","Purdue University, USA.",30222157,"10.3791/56969 ","Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components  and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol  describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates,  enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.","fish","Streptococcus pyogenesのクラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（CRISPR）システムの特性評価により、ゼブラフィッシュを含む多種多様な生物で遺伝子修飾を迅速に生成するためのカスタマイズ可能なプラットフォームの開発が可能になりました。CRISPRベースのゲノム編集では、単一のガイドRNA（sgRNA）を使用して、CRISPR関連（Cas）エンドヌクレアーゼを目的のゲノムDNA（gDNA）ターゲットにターゲティングし、Casエンドヌクレアーゼが二本鎖切断（DSB）を生成します。エラーが発生しやすいメカニズムによるDSBの修復は、挿入および/または削除（インデル）につながります。これは、コード配列内に時期尚早の終止コドンを導入することが多いフレームシフト突然変異を引き起こし、タンパク質ヌル対立遺伝子を作成する可能性があります。CRISPRベースのゲノムエンジニアリングは、わずかな分子成分しか必要とせず、マイクロインジェクションによってゼブラフィッシュの胚に簡単に導入されます。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュのマイクロインジェクション用のCRISPR試薬を生成し、CRISPRで修飾された遺伝子の生殖細胞系伝達を示す魚を特定するために使用される方法について説明します。これらの方法には、sgRNAのin vitro転写、CRISPR試薬のマイクロインジェクション、ヘテロデュプレックスモビリティアッセイ（HMA）と呼ばれるPCRベースの方法を使用した標的部位で誘導されたインデルの同定、および低スループットと強力な両方を使用したインデルの特性評価が含まれます。ヘテロ接合魚から収集された複数のPCR産物を分析できる次世代シーケンシング（NGS）ベースのアプローチ。このプロトコルは、必要な魚の数と分析を実行するために必要な機器の種類の両方を最小限に抑えるために合理化されています。さらに、このプロトコルは、学部生を含むすべてのレベルの経験の研究室の個人が使用できるように設計されており、この強力なツールをゼブラフィッシュでCRISPRベースのゲノム修飾を行うことに関心のある研究グループが経済的に使用できるようにします。"]
[166,29654263,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","ptch1","Leukemia","Hedgehog pathway mutations drive oncogenic transformation in high-risk T-cell acute lymphoblastic leukemia.",2018,"32(10):2126-2137","[Burns MA et al.]","Boston Children's Hospital, Boston, MA, USA.",29654263,"10.1038/s41375-018-0097-x ","The role of Hedgehog signaling in normal and malignant T-cell development is controversial. Recently, Hedgehog pathway mutations have been described in T-ALL, but whether mutational activation of Hedgehog signaling drives T-cell transformation is unknown, hindering the rationale for therapeutic intervention.  Here, we show that Hedgehog pathway mutations predict chemotherapy resistance in  human T-ALL, and drive oncogenic transformation in a zebrafish model of the disease. We found Hedgehog pathway mutations in 16% of 109 childhood T-ALL cases, most commonly affecting its negative regulator PTCH1. Hedgehog mutations were associated with resistance to induction chemotherapy (P = 0.009). Transduction of wild-type PTCH1 into PTCH1-mutant T-ALL cells induced apoptosis (P = 0.005), a phenotype that was reversed by downstream Hedgehog pathway activation (P = 0.007). Transduction of most mutant PTCH1, SUFU, and GLI alleles into mammalian cells induced aberrant regulation of Hedgehog signaling, indicating that these mutations are pathogenic. Using a CRISPR/Cas9 system for lineage-restricted gene  disruption in transgenic zebrafish, we found that ptch1 mutations accelerated the onset of notch1-induced T-ALL (P = 0.0001), and pharmacologic Hedgehog pathway inhibition had therapeutic activity. Thus, Hedgehog-activating mutations are driver oncogenic alterations in high-risk T-ALL, providing a molecular rationale  for targeted therapy in this disease.","fish","正常および悪性のT細胞の発達におけるヘッジホッグシグナル伝達の役割については議論の余地があります。最近、ヘッジホッグ経路の変異がT-ALLに記載されていますが、ヘッジホッグシグナル伝達の変異活性化がT細胞の形質転換を促進するかどうかは不明であり、治療的介入の理論的根拠を妨げています。ここでは、ヘッジホッグ経路の変異がヒトT-ALLの化学療法抵抗性を予測し、この疾患のゼブラフィッシュモデルで発癌性形質転換を促進することを示しています。ヘッジホッグ経路の変異は、小児期のT-ALL症例109例の16％で見られ、最も一般的にはその負の調節因子PTCH1に影響を及ぼしています。ヘッジホッグ変異は、誘導化学療法に対する耐性と関連していた（P = 0.009）。野生型PTCH1のPTCH1変異T-ALL細胞への伝達は、アポトーシスを誘導し（P = 0.005）、表現型は下流のヘッジホッグ経路の活性化によって逆転しました（P = 0.007）。ほとんどの変異PTCH1、SUFU、およびGLI対立遺伝子の哺乳動物細胞への形質導入は、ヘッジホッグシグナル伝達の異常な調節を誘導し、これらの変異が病原性であることを示しています。トランスジェニックゼブラフィッシュの系統制限遺伝子破壊にCRISPR / Cas9システムを使用して、ptch1変異がnotch1誘発T-ALLの発症を加速し（P = 0.0001）、薬理学的ヘッジホッグ経路阻害が治療活性を有することを発見しました。したがって、ヘッジホッグ活性化変異は、高リスクT-ALLにおけるドライバーの発癌性変化であり、この疾患の標的療法の分子的根拠を提供します。"]
[167,29374849,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","red fluorescence protein","Marine biotechnology","Zebrafish Embryonic Slow Muscle Is a Rapid System for Genetic Analysis of Sarcomere Organization by CRISPR/Cas9, but Not NgAgo.",2018,"20(2):168-181","[Cai M et al.]","University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA.",29374849,"10.1007/s10126-018-9794-8 ","Zebrafish embryonic slow muscle cells, with their superficial localization and clear sarcomere organization, provide a useful model system for genetic analysis  of muscle cell differentiation and sarcomere assembly. To develop a quick assay for testing CRISPR-mediated gene editing in slow muscles of zebrafish embryos, we targeted a red fluorescence protein (RFP) reporter gene specifically expressed in slow muscles of myomesin-3-RFP (Myom3-RFP) zebrafish embryos. We demonstrated that microinjection of RFP-sgRNA with Cas9 protein or Cas9 mRNA resulted in a mosaic pattern in loss of RFP expression in slow muscle fibers of the injected zebrafish embryos. To uncover gene functions in sarcomere organization, we targeted two endogenous genes, slow myosin heavy chain-1 (smyhc1) and heat shock  protein 90 alpha1 (hsp90alpha1), which are specifically expressed in zebrafish muscle cells. We demonstrated that injection of Cas9 protein or mRNA with respective sgRNAs targeted to smyhc1 or hsp90a1 resulted in a mosaic pattern of myosin thick filament disruption in slow myofibers of the injected zebrafish embryos. Moreover, Myom3-RFP expression and M-line localization were also abolished in these defective myofibers. Given that zebrafish embryonic slow muscles are a rapid in vivo system for testing genome editing and uncovering gene functions in muscle cell differentiation, we investigated whether microinjection  of Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) system could induce genetic mutations and muscle defects in zebrafish embryos. Single-strand guide DNAs targeted to RFP, Smyhc1, or Hsp90alpha1 were injected with NgAgo mRNA into Myom3-RFP zebrafish embryos. Myom3-RFP expression was analyzed in the injected embryos. The results showed that, in contrast to the CRISPR/Cas9 system, injection of the NgAgo-gDNA system did not affect Myom3-RFP expression and sarcomere organization in myofibers of the injected embryos. Sequence analysis failed to detect genetic mutations at the target genes. Together, our studies demonstrate that zebrafish embryonic slow muscle is a rapid model for testing gene editing technologies in vivo and uncovering gene functions in muscle cell differentiation.","fish","ゼブラフィッシュの胚性遅筋細胞は、表面的な局在と明確なサルコメア組織を備えており、筋細胞の分化とサルコメアの集合の遺伝子解析に役立つモデルシステムを提供します。ゼブラフィッシュ胚の遅い筋肉でCRISPRを介した遺伝子編集をテストするための迅速なアッセイを開発するために、ミオメシン-3-RFP（Myom3-RFP）ゼブラフィッシュ胚の遅い筋肉で特異的に発現する赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーター遺伝子を標的としました。我々は、Cas9タンパク質またはCas9 mRNAを用いたRFP-sgRNAのマイクロインジェクションが、注入されたゼブラフィッシュ胚の遅い筋線維におけるRFP発現の喪失のモザイクパターンをもたらすことを実証しました。サルコメア組織における遺伝子機能を明らかにするために、ゼブラフィッシュの筋肉細胞で特異的に発現する2つの内因性遺伝子である低速ミオシン重鎖-1（smyhc1）と熱ショックタンパク質90 alpha1（hsp90alpha1）を標的としました。smyhc1またはhsp90a1を標的とするそれぞれのsgRNAをCas9タンパク質またはmRNAに注入すると、注入されたゼブラフィッシュ胚の遅い筋線維にミオシンの太いフィラメント破壊のモザイクパターンが生じることを示しました。さらに、Myom3-RFPの発現とMラ​​インのローカリゼーションもこれらの欠陥のある筋線維で廃止されました。ゼブラフィッシュ胚性遅筋は、ゲノム編集をテストし、筋細胞分化における遺伝子機能を明らかにするための迅速なインビボシステムであることを考慮して、Natronobacterium gregoryi Argonaute（NgAgo）システムのマイクロインジェクションがゼブラフィッシュ胚の遺伝子変異および筋肉欠損を誘発できるかどうかを調査した。RFP、Smyhc1、またはHsp90alpha1をターゲットとする一本鎖ガイドDNAに、NgAgomRNAをMyom3-RFPゼブラフィッシュ胚に注入しました。Myom3-RFPの発現は注入された胚で分析されました。結果は、CRISPR / Cas9システムとは対照的に、NgAgo-gDNAシステムの注入は注入された胚の筋線維におけるMyom3-RFP発現とサルコメア組織に影響を与えなかったことを示しました。配列分析では、標的遺伝子の遺伝子変異を検出できませんでした。一緒に、私たちの研究は、ゼブラフィッシュ胚の遅い筋肉が生体内で遺伝子編集技術をテストし、筋肉細胞分化における遺伝子機能を明らかにするための迅速なモデルであることを示しています。"]
[168,29723654,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","CCCTC-binding factor","Mechanisms of development","CTCF knockout reveals an essential role for this protein during the zebrafish development.",2018,"154:51-59","[Carmona-Aldana F et al.]","Universidad  Nacional Autonoma de Mexico, Ciudad de Mexico, Mexico.",29723654,"10.1016/j.mod.2018.04.006 ","Chromatin regulation and organization are essential processes that regulate gene  activity. The CCCTC-binding factor (CTCF) is a protein with different and important molecular functions related with chromatin dynamics. It is conserved since invertebrates to vertebrates, posing it as a factor with an important role  in the physiology. In this work, we aimed to understand the distribution and functional relevance of CTCF during the embryonic development of the zebrafish (Danio rerio). We generated a zebrafish specific anti-Ctcf antibody, and found this protein to be ubiquitous, through different stages and tissues. We used the  CRISPR-Cas9 system to induce molecular alterations in the locus. This resulted in early lethality. We delayed the lethality performing knockdown morpholino experiments, and found an aberrant embryo morphology involving malformations in structures through all the length of the embryo. These phenotypes were rescued with human CTCF mRNA injections, showing the specificity of the morpholinos and a partial functional conservation between the fish and the human proteins. Lastly,  we found that the pro-apoptotic genes p53 and bbc3/PUMA are deregulated in the ctcf morpholino-injected embryos. In conclusion, CTCF is a ubiquitous factor during the zebrafish development, which regulates the correct formation of different structures of the embryo, and its deregulation impacts on essential cell survival genes. Overall, this work provides a basis to look for the particular functions of CTCF in the different developing tissues and organs of the zebrafish.","fish","クロマチンの調節と組織化は、遺伝子活性を調節する重要なプロセスです。CCCTC結合因子（CTCF）は、クロマチンダイナミクスに関連するさまざまな重要な分子機能を持つタンパク質です。無脊椎動物から脊椎動物まで保存されており、生理学において重要な役割を果たしている要因として位置づけられています。この作業では、ゼブラフィッシュ（Daniorerio）の胚発生時のCTCFの分布と機能的関連性を理解することを目的としました。ゼブラフィッシュ特異的抗Ctcf抗体を生成し、このタンパク質がさまざまな段階や組織を通じて遍在していることを発見しました。CRISPR-Cas9システムを使用して遺伝子座の分子変化を誘導しました。これは早期の致死性をもたらしました。ノックダウンモルホリノ実験を行って致死性を遅らせ、胚の全長にわたって構造の奇形を含む異常な胚の形態を発見しました。これらの表現型は、ヒトCTCF mRNA注射で救出され、モルホリノの特異性と、魚とヒトタンパク質の間の部分的な機能的保存を示しています。最後に、アポトーシス促進遺伝子p53およびbbc3 / PUMAが、ctcfモルホリノを注入した胚で調節解除されていることを発見しました。結論として、CTCFはゼブラフィッシュの発育中の遍在する因子であり、胚のさまざまな構造の正しい形成を調節し、その調節解除は必須の細胞生存遺伝子に影響を与えます。全体として、この作業は、ゼブラフィッシュのさまざまな発達中の組織や器官におけるCTCFの特定の機能を探すための基礎を提供します。"]
[169,29777776,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","contactin2","Mechanisms of development","Distinct roles for the cell adhesion molecule Contactin2 in the development and function of neural circuits in zebrafish.",2018,"152:1-12","[Gurung S et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",29777776,"10.1016/j.mod.2018.05.005 ","Contactin2 (Cntn2)/Transient Axonal Glycoprotein 1 (Tag1), a neural cell adhesion molecule, has established roles in neuronal migration and axon fasciculation in chick and mouse. In zebrafish, antisense morpholino-based studies have indicated  roles for cntn2 in the migration of facial branchiomotor (FBM) neurons, the guidance of the axons of the nucleus of the medial longitudinal fascicle (nucMLF), and the outgrowth of Rohon-Beard (RB) central axons. To study functions of Cntn2 in later stages of neuronal development, we generated cntn2 mutant zebrafish using CRISPR-Cas9. Using a null mutant allele, we detected genetic interactions between cntn2 and the planar cell polarity gene vangl2, as shown previously with cntn2 morphants, demonstrating a function for cntn2 during FBM neuron migration in a sensitized background of reduced planar cell polarity signaling. In addition, maternal-zygotic (MZ) cntn2 mutant larvae exhibited aberrant touch responses and swimming, suggestive of defects in sensorimotor circuits, consistent with studies in mice. However, the nucMLF axon convergence,  FBM neuron migration, and RB outgrowth defects seen in morphants were not seen in the mutants, and we show here that they are likely off-target effects of morpholinos. However, MLF axons exhibited local defasciculation in MZcntn2 mutants, consistent with a role for Cntn2 in axon fasciculation. These data demonstrate distinct roles for zebrafish cntn2 in neuronal migration and axon fasciculation, and in the function of sensorimotor circuits.","fish","Contactin2（Cntn2）/ Transient Axonal Glycoprotein 1（Tag1）、神経細胞接着分子は、ニワトリとマウスの神経細胞の移動と軸索の線維束性収縮において役割を確立しています。ゼブラフィッシュでは、アンチセンスモルホリノベースの研究により、顔面分枝運動（FBM）ニューロンの移動、内側縦束（nucMLF）の核の軸索のガイダンス、およびRohon-Beard（RB）の伸長におけるcntn2の役割が示されています。 ）中央軸索。神経発生の後期におけるCntn2の機能を研究するために、CRISPR-Cas9を使用してcntn2変異ゼブラフィッシュを生成しました。ヌル変異対立遺伝子を使用して、cntn2変異体で以前に示したように、cntn2と平面細胞極性遺伝子vangl2の間の遺伝的相互作用を検出し、平面細胞極性シグナル伝達が低下した感作バックグラウンドでのFBMニューロン移動中のcntn2の機能を示しました。さらに、母体接合（MZ）cntn2変異体の幼虫は、異常な接触反応と水泳を示し、マウスでの研究と一致して、感覚運動回路の欠陥を示唆しています。ただし、変異体で見られたnucMLF軸索収束、FBMニューロンの移行、およびRB伸長欠陥は、変異体では見られなかった、そしてここでそれらがモルホリノのオフターゲット効果である可能性が高いことを示します。ただし、MLF軸索は、軸索の線維束性収縮におけるCntn2の役割と一致して、MZcntn2変異体で局所的な線維束性収縮を示した。これらのデータは、ニューロンの移動と軸索の線維束性収縮、および感覚運動回路の機能におけるゼブラフィッシュcntn2の明確な役割を示しています。"]
[170,30076894,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;"," ","Methods","Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.",2018,"150:19-23","[Qin W et al.]","Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen, China.",30076894,"10.1016/j.ymeth.2018.07.010 ","The use of CRISPR/Cas9 to knockout genes in zebrafish has been well established.  However, to better model many human diseases that are caused by point mutations,  a robust methodology for generating desirable DNA base changes is still needed. Recently, Cas9-linked cytidine deaminases (base editors) evolved as a strategy to introduce single base mutations in model organisms. They have been used to convert cytidine to thymine at specific genomic loci. Here we describe a protocol for using the base editing system in zebrafish and its application to reproduce a single base mutation observed in human Ablepharon-Macrostomia Syndrome.","fish","ゼブラフィッシュの遺伝子をノックアウトするためのCRISPR / Cas9の使用は十分に確立されています。ただし、点突然変異によって引き起こされる多くの人間の病気をより適切にモデル化するには、望ましいDNA塩基の変化を生成するための堅牢な方法論が依然として必要です。最近、Cas9にリンクされたシチジンデアミナーゼ（塩基編集者）は、モデル生物に単一の塩基変異を導入するための戦略として進化しました。それらは、特定のゲノム遺伝子座でシチジンをチミンに変換するために使用されてきました。ここでは、ゼブラフィッシュの塩基編集システムを使用するためのプロトコルと、ヒトAblepharon-Macrostomia症候群で観察される単一の塩基変異を再現するためのそのアプリケーションについて説明します。"]
[171,29964176,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cpf1;"," ","Methods","Optimized CRISPR-Cpf1 system for genome editing in zebrafish.",2018,"150:11-18","[Fernandez JP et al.]","Yale University School of Medicine, New Haven, CT,  USA.",29964176,"10.1016/j.ymeth.2018.06.014 ","The impact of the CRISPR-Cas biotechnological systems has recently broadened the  genome editing toolbox available to different model organisms further with the addition of new efficient RNA-guided endonucleases. We have recently optimized CRISPR-Cpf1 (renamed Cas12a) system in zebrafish. We showed that (i) in the absence of Cpf1 protein, crRNAs are unstable and degraded in vivo, and CRISPR-Cpf1 RNP complexes efficiently mutagenize the zebrafish genome; and (ii) temperature modulates Cpf1 activity especially affecting AsCpf1, which experiences a reduced performance below 37 degrees C. Here, we describe a step-by-step protocol on how to easily design and generate crRNAs in vitro, purify recombinant Cpf1 proteins, and assemble ribonucleoprotein complexes to carry out efficient mutagenesis in zebrafish in a constitutive and temperature-controlled manner. Finally, we explain how to induce Cpf1-mediated homology-directed repair using single-stranded DNA oligonucleotides. In summary,  this protocol includes the steps to efficiently modify the zebrafish genome and other ectothermic organisms using the CRISPR-Cpf1 system.","fish","CRISPR-Casバイオテクノロジーシステムの影響により、最近、新しい効率的なRNA誘導エンドヌクレアーゼが追加され、さまざまなモデル生物が利用できるゲノム編集ツールボックスがさらに広がりました。最近、ゼブラフィッシュでCRISPR-Cpf1（Cas12aに改名）システムを最適化しました。（i）Cpf1タンパク質がない場合、crRNAは不安定で、in vivoで分解され、CRISPR-Cpf1RNP複合体はゼブラフィッシュゲノムを効率的に変異誘発することを示しました。（ii）温度はCpf1活性を調節し、特にAsCpf1に影響を及ぼします。AsCpf1は37℃未満でパフォーマンスが低下します。ここでは、in vitroでcrRNAを簡単に設計および生成し、組換えCpf1タンパク質を精製し、リボヌクレオプロテイン複合体を組み立てて、構成的かつ温度制御された方法でゼブラフィッシュの効率的な突然変異誘発を実行します。最後に、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを使用してCpf1を介した相同性指向修復を誘導する方法について説明します。要約すると、このプロトコルには、CRISPR-Cpf1システムを使用してゼブラフィッシュゲノムおよびその他の発熱性生物を効率的に改変するためのステップが含まれています。"]
[172,29619162,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","shank3b","Molecular autism","CRISPR/Cas9-induced shank3b mutant zebrafish display autism-like behaviors.",2018,"9:23","[Liu CX et al.]","Fudan University, Shanghai, China.",29619162,"10.1186/s13229-018-0204-x ","Background: Human genetic and genomic studies have supported a strong causal role of SHANK3 deficiency in autism spectrum disorder (ASD). However, the molecular mechanism underlying SHANK3 deficiency resulting in ASD is not fully understood.  Recently, the zebrafish has become an attractive organism to model ASD because of its high efficiency of genetic manipulation and robust behavioral phenotypes. The orthologous gene to human SHANK3 is duplicated in the zebrafish genome and has two homologs, shank3a and shank3b. Previous studies have reported shank3 morphants in zebrafish using the morpholino method. Here, we report the generation and characterization of shank3b mutant zebrafish in larval and adult stages using the CRISPR/Cas9 genome editing technique. Methods: CRISPR/Cas9 was applied to generate a shank3b loss-of-function mutation (shank3b(-/-) ) in zebrafish. A series of morphological measurements, behavioral tests, and molecular analyses were performed to systematically characterize the behavioral and molecular changes in shank3b mutant zebrafish. Results: shank3b(-/-) zebrafish exhibited abnormal morphology in early development. They showed reduced locomotor activity both as larvae and adults, reduced social interaction and time spent near conspecifics, and significant repetitive swimming behaviors. Additionally, the levels of both postsynaptic homer1 and presynaptic synaptophysin were significantly reduced in the adult brain of shank3b-deficient  zebrafish. Conclusions: We generated the first inheritable shank3b mutant zebrafish model using CRISPR/Cas9 gene editing approach. shank3b(-/-) zebrafish displayed robust autism-like behaviors and altered levels of the synaptic proteins homer1 and synaptophysin. The versatility of zebrafish as a model for studying neurodevelopment and conducting drug screening will likely have a significant contribution to future studies of human SHANK3 function and ASD.","fish","背景：人間の遺伝的およびゲノム的研究は、自閉症スペクトラム障害（ASD）におけるSHANK3欠損症の強力な因果的役割を支持してきました。ただし、ASDをもたらすSHANK3欠損症の根底にある分子メカニズムは完全には理解されていません。最近、ゼブラフィッシュは、遺伝子操作の効率が高く、行動表現型が堅牢であるため、ASDをモデル化する魅力的な生物になりました。ヒトSHANK3のオーソロガス遺伝子はゼブラフィッシュのゲノムに複製されており、shank3aとshank3bの2つの相同体があります。以前の研究では、モルホリノ法を使用したゼブラフィッシュのshank3変異体が報告されています。ここでは、CRISPR / Cas9ゲノム編集技術を使用して、幼虫期および成体期のshank3b変異ゼブラフィッシュの生成と特性評価について報告します。方法：CRISPR / Cas9を適用して、ゼブラフィッシュでshank3bの機能喪失型変異（shank3b（-/-））を生成しました。一連の形態学的測定、行動試験、および分子分析を実施して、shank3b変異ゼブラフィッシュの行動および分子の変化を体系的に特徴付けました。結果：shank3b（-/-）ゼブラフィッシュは初期の発達で異常な形態を示した。彼らは、幼虫と成虫の両方としての自発運動の減少、社会的相互作用の減少と同種の近くで過ごす時間の減少、および有意な反復水泳行動を示した。さらに、シナプス後ホーマー1とシナプス前シナプトフィジンの両方のレベルは、shank3b欠損ゼブラフィッシュの成人の脳で有意に減少しました。結論：CRISPR / Cas9遺伝子編集アプローチを使用して、最初の継承可能なshank3b変異ゼブラフィッシュモデルを生成しました。shank3b（-/-）ゼブラフィッシュは、強い自閉症のような行動を示し、シナプスタンパク質homer1とシナプトフィジンのレベルが変化しました。神経発達を研究し、薬物スクリーニングを実施するためのモデルとしてのゼブラフィッシュの多様性は、ヒトのSHANK3機能とASDの将来の研究に大きく貢献する可能性があります。"]
[173,29203238,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","erythropoietin; erythropoietin receptor","Molecular metabolism","Targeting erythropoietin protects against proteinuria in type 2 diabetic patients and in zebrafish.",2018,"8:189-202","[She J et al.]","First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an, China.",29203238,"10.1016/j.molmet.2017.11.006 ","OBJECTIVE: Adult human kidneys produce erythropoietin (EPO), which regulates red  blood cell formation; however, whether EPO also functions directly on kidney development and controls diabetic kidney disease remains unknown. Here we analyzed the role of EPO in kidney development and under hyperglycemic conditions in zebrafish and in humans. METHODS: Diabetic patients and respective controls were enrolled in two cohorts. Serum EPO level and urine protein change upon human EPO administration were then analyzed. Transient knockdown and permanent knockout of EPO and EPOR in renal TG(WT1B:EGFP) zebrafish were established using the morpholino technology and CRISPR/Cas9 technology. Zebrafish embryos were phenotypically analyzed using fluorescence microscopy, and functional assays were carried out with the help of TexasRed labeled 70 kDa Dextran. Apoptosis was determined using the TUNEL assay and Annexin V staining, and caspase inhibitor zVADfmk was used for rescue experiments. RESULTS: In type 2 diabetic patients, serum EPO level decreased with the duration of diabetes, which was linked to reduced kidney function. Human recombinant EPO supplementation ameliorated proteinuria in diabetic nephropathy patients. In zebrafish, loss-of-function studies for EPO and EPOR, showed morphological and functional alterations within  the pronephros, adversely affecting pronephric structure, leading to slit diaphragm dysfunction by increasing apoptosis within the pronephros. Induction of hyperglycemia in zebrafish embryos induced pronephros alterations which were further worsened upon silencing of EPO expression. CONCLUSIONS: EPO was identified as a direct renal protective factor, promoting renal embryonic development and protecting kidneys from hyperglycemia induced nephropathy.","fish","目的：成人の腎臓は、赤血球形成を調節するエリスロポエチン（EPO）を産生します。ただし、EPOが腎臓の発達に直接機能し、糖尿病性腎疾患を制御するかどうかは不明なままです。ここでは、ゼブラフィッシュとヒトの腎臓の発達と高血糖状態でのEPOの役割を分析しました。方法：糖尿病患者とそれぞれのコントロールは、2つのコホートに登録されました。次に、ヒトEPO投与時の血清EPOレベルおよび尿タンパク質の変化を分析した。腎TG（WT1B：EGFP）ゼブラフィッシュにおけるEPOおよびEPORの一時的なノックダウンと永続的なノックアウトは、モルホリノ技術とCRISPR / Cas9技術を使用して確立されました。ゼブラフィッシュの胚は、蛍光顕微鏡を使用して表現型的に分析され、機能アッセイは、TexasRedで標識された70kDaのDextranの助けを借りて実行されました。アポトーシスは、TUNELアッセイとアネキシンV染色を使用して決定され、カスパーゼ阻害剤zVADfmkがレスキュー実験に使用されました。結果：2型糖尿病患者では、血清EPOレベルは糖尿病の期間とともに減少し、これは腎機能の低下に関連していました。ヒト組換えEPO補給は、糖尿病性腎症患者のタンパク尿を改善しました。ゼブラフィッシュでは、EPOとEPORの機能喪失研究により、前腎内の形態学的および機能的変化が前腎構造に悪影響を及ぼし、前腎内のアポトーシスを増加させることによりスリットダイアフラム機能障害を引き起こすことが示されました。ゼブラフィッシュ胚における高血糖の誘発は、前腎の変化を誘発し、EPO発現のサイレンシングによりさらに悪化した。結論：EPOは、腎胚の発達を促進し、高血糖誘発性腎症から腎臓を保護する直接的な腎保護因子として同定されました。"]
[174,30210230,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","rhodopsin","Molecular vision","Targeted disruption of the endogenous zebrafish rhodopsin locus as models of rapid rod photoreceptor degeneration.",2018,"24:587-602. eCollection 2018. ","[Zelinka CP et al.]","Florida State University, Tallahassee, FL, USA.",30210230,null,"Purpose: Retinitis pigmentosa (RP) is a collection of genetic disorders that results in the degeneration of light-sensitive photoreceptor cells, leading to blindness. RP is associated with more than 70 loci that may display dominant or recessive modes of inheritance, but mutations in the gene encoding the visual pigment rhodopsin (RHO) are the most frequent cause. In an effort to develop precise mutations in zebrafish as novel models of photoreceptor degeneration, we  describe the generation and germline transmission of a series of novel clustered  regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-induced insertion and deletion (indel) mutations in the major zebrafish rho locus, rh1-1. Methods:  One- or two-cell staged zebrafish embryos were microinjected with in vitro transcribed mRNA encoding Cas9 and a single guide RNA (gRNA). Mutations were detected by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and DNA sequence analyses in injected embryos and offspring. Immunolabeling with rod- and cone-specific antibodies was used to test for histological and cellular changes.  Results: Using gRNAs that targeted highly conserved regions of rh1-1, a series of dominant and recessive alleles were recovered that resulted in the rapid degeneration of rod photoreceptors. No effect on cones was observed. Targeting the 5'-coding sequence of rh1-1 led to the recovery of several indels similar to  disease-associated alleles. A frame shift mutation leading to a premature stop codon (T17*) resulted in rod degeneration when brought to homozygosity. Immunoblot and fluorescence labeling with a Rho-specific antibody suggest that this is indeed a null allele, illustrating that the Rho expression is essential for rod survival. Two in-frame mutations were recovered that disrupted the highly conserved N-linked glycosylation consensus sequence at N15. Larvae heterozygous for either of the alleles demonstrated rapid rod degeneration. Targeting of the 3'-coding region of rh1-1 resulted in the recovery of an allele encoding a premature stop codon (S347*) upstream of the conserved VSPA sorting sequence and  a second in-frame allele that disrupted the putative phosphorylation site at S339. Both alleles resulted in rod death in a dominant inheritance pattern. Following the loss of the targeting sequence, immunolabeling for Rho was no longer restricted to the rod outer segment, but it was also localized to the plasma membrane. Conclusions: The efficiency of CRISPR/Cas9 for gene targeting, coupled with the large number of mutations associated with RP, provided a backdrop for the rapid isolation of novel alleles in zebrafish that phenocopy disease. These novel lines will provide much needed in-vivo models for high throughput screens of compounds or genes that protect from photoreceptor degeneration.","fish","目的：網膜色素変性症（RP）は、光感受性光受容細胞の変性を引き起こし、失明につながる遺伝性疾患の集まりです。RPは、優性または劣性の遺伝形式を示す可能性のある70以上の遺伝子座に関連していますが、視覚色素ロドプシン（RHO）をコードする遺伝子の変異が最も頻繁な原因です。ゼブラフィッシュの正確な突然変異を光受容体変性の新しいモデルとして開発するために、一連の新しいクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9によって誘発される挿入と削除（インデル）突然変異の生成と生殖細胞系列伝達について説明します。主要なゼブラフィッシュのrho遺伝子座、rh1-1。方法：1細胞または2細胞の段階的ゼブラフィッシュ胚に、Cas9をコードするinvitro転写mRNAとシングルガイドRNA（gRNA）をマイクロインジェクションしました。突然変異は、制限酵素断片長多型（RFLP）と注入された胚と子孫のDNA配列分析によって検出されました。ロッドおよびコーンに特異的な抗体による免疫標識を使用して、組織学的および細胞の変化をテストしました。結果：rh1-1の高度に保存された領域を標的としたgRNAを使用して、一連の優性および劣性対立遺伝子が回収され、桿体光受容体の急速な変性をもたらしました。コーンへの影響は観察されませんでした。rh1-1の5 'コード配列を標的とすることで、疾患関連対立遺伝子と同様のいくつかのインデルが回復しました。早期停止コドン（T17 *）につながるフレームシフト変異は、ホモ接合性になると桿体変性を引き起こしました。Rho特異的抗体による免疫ブロットおよび蛍光標識は、これが実際にヌル対立遺伝子であることを示唆しており、Rho発現が桿体の生存に不可欠であることを示しています。N15で高度に保存されたN結合型グリコシル化コンセンサス配列を破壊する2つのインフレーム変異が回収されました。いずれかの対立遺伝子についてヘテロ接合性の幼虫は、急速な桿体変性を示した。rh1-1の3 'コーディング領域をターゲットにすると、保存されたVSPAソーティングシーケンスの上流にある早期停止コドン（S347 *）をエンコードするアレルと、S339の推定リン酸化部位を破壊する2番目のインフレームアレルが回復しました。 。両方の対立遺伝子は、優性遺伝パターンで桿体死をもたらしました。ターゲティング配列が失われた後、Rhoの免疫標識はロッドの外側のセグメントに限定されなくなりましたが、原形質膜にも局在していました。結論：遺伝子ターゲティングに対するCRISPR / Cas9の効率は、RPに関連する多数の変異と相まって、ゼブラフィッシュの表現型検査疾患における新規対立遺伝子の迅速な分離の背景を提供しました。これらの新しいラインは、光受容体の変性から保護する化合物または遺伝子のハイスループットスクリーニングに非常に必要な生体内モデルを提供します。"]
[175,30333491,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","titin","Nature communications","Rare truncating variants in the sarcomeric protein titin associate with familial  and early-onset atrial fibrillation.",2018,"9(1):4316","[Ahlberg G et al.]","Rigshospitalet, University Hospital of Copenhagen, Copenhagen, Denmark.",30333491,"10.1038/s41467-018-06618-y ","A family history of atrial fibrillation constitutes a substantial risk of developing the disease, however, the pathogenesis of this complex disease is poorly understood. We perform whole-exome sequencing on 24 families with at least three family members diagnosed with atrial fibrillation (AF) and find that titin-truncating variants (TTNtv) are significantly enriched in these patients (P = 1.76 x 10(-6)). This finding is replicated in an independent cohort of early-onset lone AF patients (n = 399; odds ratio = 36.8; P = 4.13 x 10(-6)). A CRISPR/Cas9 modified zebrafish carrying a truncating variant of titin is used to  investigate TTNtv effect in atrial development. We observe compromised assembly of the sarcomere in both atria and ventricle, longer PR interval, and heterozygous adult zebrafish have a higher degree of fibrosis in the atria, indicating that TTNtv are important risk factors for AF. This aligns with the early onset of the disease and adds an important dimension to the understanding of the molecular predisposition for AF.","fish","心房細動の家族歴は、病気を発症する実質的なリスクを構成しますが、この複雑な病気の病因はよくわかっていません。心房線維化（AF）と診断された少なくとも3人の家族がいる24家族で全エクソームシーケンスを実行し、これらの患者でタイチン短縮変異体（TTNtv）が有意に濃縮されていることを発見しました（P = 1.76 x 10（-6））。この発見は、早期発症型の孤独なAF患者の独立したコホートで再現されています（n = 399;オッズ比= 36.8; P = 4.13 x 10（-6））。チチンのトランケートバリアントを運ぶCRISPR / Cas9修飾ゼブラフィッシュは、心房発達におけるTTNtv効果を調査するために使用されます。心房と心室の両方でサルコメアの組み立てが損なわれ、PR間隔が長くなり、ヘテロ接合の成体ゼブラフィッシュは心房で線維化の程度が高く、TTNtvがAFの重要な危険因子であることを示しています。これは、疾患の早期発症と一致し、心房細動の分子素因の理解に重要な側面を追加します。"]
[176,30137487,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","mtu1","Nucleic acids research","Deletion of Mtu1 (Trmu) in zebrafish revealed the essential role of tRNA modification in mitochondrial biogenesis and hearing function.",2018,"46(20):10930-10945","[Zhang Q et al.]","Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, Zhejiang, China.",30137487,"10.1093/nar/gky758 ","Mtu1(Trmu) is a highly conserved tRNA modifying enzyme responsible for the biosynthesis of taum5s2U at the wobble position of tRNAGln, tRNAGlu and tRNALys.  Our previous investigations showed that MTU1 mutation modulated the phenotypic manifestation of deafness-associated mitochondrial 12S rRNA mutation. However, the pathophysiology of MTU1 deficiency remains poorly understood. Using the mtu1  knock-out zebrafish generated by CRISPR/Cas9 system, we demonstrated the abolished 2-thiouridine modification of U34 of mitochondrial tRNALys, tRNAGlu and tRNAGln in the mtu1 knock-out zebrafish. The elimination of this post-transcriptional modification mediated mitochondrial tRNA metabolisms, causing the global decreases in the levels of mitochondrial tRNAs. The aberrant mitochondrial tRNA metabolisms led to the impairment of mitochondrial translation, respiratory deficiencies and reductions of mitochondrial ATP production. These mitochondria dysfunctions caused the defects in hearing organs. Strikingly, mtu1-/- mutant zebrafish displayed the abnormal startle response and  swimming behaviors, significant decreases in the sizes of saccular otolith and numbers of hair cells in the auditory and vestibular organs. Furthermore, mtu1-/- mutant zebrafish exhibited the significant reductions in the hair bundle densities in utricle, saccule and lagena. Therefore, our findings may provide new insights into the pathophysiology of deafness, which was manifested by the deficient modifications at wobble position of mitochondrial tRNAs.","fish","Mtu1（Trmu）は、tRNAGln、tRNAGlu、およびtRNALysのゆらぎ位置でのtaum5s2Uの生合成に関与する高度に保存されたtRNA修飾酵素です。私たちの以前の調査は、MTU1変異が難聴関連ミトコンドリア12SrRNA変異の表現型の発現を調節することを示しました。ただし、MTU1欠損症の病態生理はよくわかっていないままです。CRISPR / Cas9システムによって生成されたmtu1ノックアウトゼブラフィッシュを使用して、mtu1ノックアウトゼブラフィッシュのミトコンドリアtRNALys、tRNAGlu、およびtRNAGlnのU34の廃止された2-チオウリジン修飾を示しました。この転写後修飾の排除はミトコンドリアtRNA代謝を媒介し、ミトコンドリアtRNAのレベルの全体的な減少を引き起こします。異常なミトコンドリアtRNA代謝は、ミトコンドリア翻訳の障害、呼吸不全、およびミトコンドリアATP産生の低下をもたらしました。これらのミトコンドリアの機能不全は、聴覚器官の欠陥を引き起こしました。驚くべきことに、mtu1-/-変異ゼブラフィッシュは、異常な驚愕反応と遊泳行動、球形嚢耳石のサイズの有意な減少、聴覚および前庭器官の有毛細胞の数を示しました。さらに、mtu1-/-変異ゼブラフィッシュは、卵形嚢、球形嚢、およびラゲナの毛束密度の有意な減少を示しました。したがって、私たちの調査結果は、ミトコンドリアtRNAのゆらぎ位置での不十分な変更によって明らかにされた難聴の病態生理学への新しい洞察を提供する可能性があります。"]
[177,29905858,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;"," ","Nucleic acids research","Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9.",2018,"46(17):e102","[Prykhozhij SV et al.]","Dalhousie University, Halifax, NS, Canada.",29905858,"10.1093/nar/gky512 ","We have optimized point mutation knock-ins into zebrafish genomic sites using clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 reagents and single-stranded oligodeoxynucleotides. The efficiency of knock-ins was assessed by a novel application of allele-specific polymerase chain reaction and confirmed by high-throughput sequencing. Anti-sense asymmetric oligo design was found to be the most successful optimization strategy. However, cut site proximity to the mutation and phosphorothioate oligo modifications also greatly improved knock-in  efficiency. A previously unrecognized risk of off-target trans knock-ins was identified that we obviated through the development of a workflow for correct knock-in detection. Together these strategies greatly facilitate the study of human genetic diseases in zebrafish, with additional applicability to enhance CRISPR-based approaches in other animal model systems.","fish","クラスター化された規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9試薬と一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを使用して、ゼブラフィッシュゲノム部位への点突然変異ノックインを最適化しました。ノックインの効率は、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応の新しいアプリケーションによって評価され、ハイスループットシーケンシングによって確認されました。アンチセンス非対称オリゴデザインが最も成功した最適化戦略であることがわかりました。ただし、変異およびホスホロチオエートオリゴ修飾に近接した切断部位もノックイン効率を大幅に改善しました。オフターゲットトランスノックインのこれまで認識されていなかったリスクが特定され、正しいノックイン検出のためのワークフローの開発によって回避されました。これらの戦略を組み合わせることで、ゼブラフィッシュのヒト遺伝病の研究が大幅に促進され、他の動物モデルシステムでのCRISPRベースのアプローチを強化するための追加の適用性があります。"]
[178,30155373,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","forkhead box 1","PeerJ","foxr1 is a novel maternal-effect gene in fish that is required for early embryonic success.",2018,"6:e5534","[Cheung CT et al.]","INRA, Rennes, France.",30155373,"10.7717/peerj.5534 ","The family of forkhead box (Fox) transcription factors regulates gonadogenesis and embryogenesis, but the role of foxr1 in reproduction is unknown. Evolutionary history of foxr1 in vertebrates was examined and the gene was found to exist in most vertebrates, including mammals, ray-finned fish, amphibians, and sauropsids. By quantitative PCR and RNA-seq, we found that foxr1 had an ovarian-specific expression in zebrafish, a common feature of maternal-effect genes. In addition,  it was demonstrated using in situ hybridization that foxr1 was a maternally-inherited transcript that was highly expressed even in early-stage oocytes and accumulated in the developing eggs during oogenesis. We also analyzed the function of foxr1 in female reproduction using a zebrafish CRISPR/cas9 knockout model. It was observed that embryos from the foxr1-deficient females had a significantly lower survival rate whereby they either failed to undergo cell division or underwent abnormal division that culminated in growth arrest at around the mid-blastula transition and early death. These mutant-derived eggs contained dramatically increased levels of p21, a cell cycle inhibitor, and reduced rictor, a component of mTOR and regulator of cell survival, which were in line with the observed growth arrest phenotype. Our study shows for the first time that foxr1 is an essential maternal-effect gene and may be required for proper cell division and survival via the p21 and mTOR pathways. These novel findings will broaden our knowledge on the functions of specific maternal factors stored in the developing egg and the underlying mechanisms that contribute to reproductive success.","fish","フォークヘッドボックス（Fox）転写因子のファミリーは、性腺形成と胚形成を調節しますが、生殖におけるfoxr1の役割は不明です。脊椎動物におけるfoxr1の進化の歴史を調べたところ、この遺伝子は、哺乳類、光線で覆われた魚、両生類、およびサウロプシッドを含むほとんどの脊椎動物に存在することがわかりました。定量PCRとRNA-seqにより、foxr1は、母性効果遺伝子の一般的な特徴であるゼブラフィッシュで卵巣特異的な発現を示すことがわかりました。さらに、insituハイブリダイゼーションを使用して、foxr1が母性遺伝の転写物であり、初期の卵母細胞でも高度に発現し、卵形成中に発育中の卵子に蓄積することが実証されました。また、ゼブラフィッシュCRISPR / cas9ノックアウトモデルを使用して、女性の生殖におけるfoxr1の機能を分析しました。foxr1欠損雌の胚は、生存率が有意に低く、細胞分裂に失敗したか、異常分裂を起こし、胚盤葉中期移行期と早期死亡の前後で成長停止に至ったことが観察されました。これらの変異体由来の卵は、劇的に増加したレベルのp21、細胞周期阻害剤、および減少したrictor、mTORの成分および細胞生存の調節因子を含み、これらは観察された成長停止表現型と一致していました。私たちの研究は、foxr1が必須の母性効果遺伝子であり、p21およびmTOR経路を介した適切な細胞分裂と生存に必要である可能性があることを初めて示しています。これらの新しい発見は、発育中の卵子に保存されている特定の母体因子の機能と、生殖の成功に寄与する根本的なメカニズムに関する知識を広げるでしょう。"]
[179,29157578,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","GIP receptor","Peptides","Evaluation of the insulinotropic and glucose-lowering actions of zebrafish GIP in mammalian systems: Evidence for involvement of the GLP-1 receptor.",2018,"100:182-189","[Graham GV et al.]","Ulster University, Coleraine, Northern Ireland, UK.",29157578,"10.1016/j.peptides.2017.11.007 ","The insulinotropic properties of zebrafish GIP (zfGIP) were assessed in vitro using clonal pancreatic beta-cell lines and isolated mouse islets and acute effects on glucose tolerance and insulin release in vivo were evaluated in mice.  The peptide produced a dose-dependent increase in the rate of insulin release from BRIN-BD11 rat clonal beta-cells at concentrations >/=30nM. Insulin release from 1.1 B4 human clonal beta-cells and mouse islets was significantly increased  by zfGIP (10nM and 1muM). The in vitro insulinotropic activity of zfGIP was decreased after incubating BRIN-BD11 cells with the GLP-1 receptor antagonist, exendin-4(9-39) (p<0.001) and the GIP receptor antagonist, GIP (6-30) Cex-K(40)[Pal] (p<0.05) but the glucagon receptor antagonist [des-His(1),Pro(4),Glu(9)]glucagon amide was without effect. zfGIP (10nM and 1muM) produced significant increases in cAMP concentration in CHL cells transfected with the human GLP-1 receptor but was without effect on HEK293 cells  transfected with the human glucagon receptor. Conversely, zfGIP, but not human GIP, significantly stimulated insulin release from CRISPR/Cas9-engineered INS-1 clonal beta-cells from which the GIP receptor had been deleted. Intraperitoneal administration of zfGIP (25 and 75nmol/kg body weight) to mice together with an intraperitoneal glucose load (18mmol/kg body weight) produced a significant decrease in plasma glucose concentrations concomitant with an increase in insulin concentrations. The study provides evidence that the insulinotropic action of zfGIP in mammalian systems involves activation of both the GLP-1 and the GIP receptors but not the glucagon receptor.","fish","ゼブラフィッシュGIP（zfGIP）のインスリン分泌促進特性は、クローン膵臓ベータ細​​胞株と単離されたマウス膵島を使用してin vitroで評価され、耐糖能とinvivoでのインスリン放出に対する急性効果がマウスで評価されました。このペプチドは、濃度> / = 30nMでBRIN-BD11ラットクローンベータ細胞からのインスリン放出速度を用量依存的に増加させました。1.1 B4ヒトクローンベータ細胞およびマウス膵島からのインスリン放出は、zfGIP（10nMおよび1muM）によって有意に増加しました。zfGIPのinvitroインスリン分泌活性は、BRIN-BD11細胞をGLP-1受容体拮抗薬であるexendin-4（9-39）（p <0.001）およびGIP受容体拮抗薬であるGIP（6-30）Cex-とインキュベートした後に減少しました。 K（40）[Pal]（p <0.05）が、グルカゴン受容体拮抗薬[des-His（1）、Pro（4）、Glu（9）]グルカゴンアミドは効果がなかった。zfGIP（10nMおよび1muM）は、ヒトGLP-1受容体でトランスフェクトされたCHL細胞でcAMP濃度の有意な増加をもたらしましたが、ヒトグルカゴン受容体でトランスフェクトされたHEK293細胞には影響しませんでした。逆に、zfGIPは、ヒトGIPではなく、GIP受容体が削除されたCRISPR / Cas9で操作されたINS-1クローンベータ細胞からのインスリン放出を有意に刺激しました。zfGIP（25および75nmol / kg体重）を腹腔内グルコース負荷（18mmol / kg体重）と一緒にマウスに腹腔内投与すると、インスリン濃度の増加に伴う血漿グルコース濃度の有意な減少が生じました。この研究は、哺乳類のシステムにおけるzfGIPのインスリン分泌促進作用が、GLP-1とGIP受容体の両方の活性化を伴うが、グルカゴン受容体の活性化を伴わないという証拠を提供します。"]
[180,30540754,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","fanca; fancb; fancc; fancd1/brca2; fancd2; fance; fancf; fancg; fanci; fancj/brip1; fancl; fancm; fancn/palb2; fanco/rad51c; fancp/slx4; fancq/ercc4; fanct/ube2t; faap100; faap24","PLoS genetics","Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated knockout of 19 Fanconi anemia pathway genes in zebrafish revealed their roles in growth, sexual development and fertility.",2018,"14(12):e1007821","[Ramanagoudr-Bhojappa R et al.]","National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.",30540754,"10.1371/journal.pgen.1007821 ","Fanconi Anemia (FA) is a genomic instability syndrome resulting in aplastic anemia, developmental abnormalities, and predisposition to hematological and other solid organ malignancies. Mutations in genes that encode proteins of the FA pathway fail to orchestrate the repair of DNA damage caused by DNA interstrand crosslinks. Zebrafish harbor homologs for nearly all known FA genes. We used multiplexed CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis to generate loss-of-function mutants for 17 FA genes: fanca, fancb, fancc, fancd1/brca2, fancd2, fance, fancf, fancg,  fanci, fancj/brip1, fancl, fancm, fancn/palb2, fanco/rad51c, fancp/slx4, fancq/ercc4, fanct/ube2t, and two genes encoding FA-associated proteins: faap100  and faap24. We selected two indel mutations predicted to cause premature truncations for all but two of the genes, and a total of 36 mutant lines were generated for 19 genes. Generating two independent mutant lines for each gene was important to validate their phenotypic consequences. RT-PCR from homozygous mutant fish confirmed the presence of transcripts with indels in all genes. Interestingly, 4 of the indel mutations led to aberrant splicing, which may produce a different protein than predicted from the genomic sequence. Analysis of RNA is thus critical in proper evaluation of the consequences of the mutations introduced in zebrafish genome. We used fluorescent reporter assay, and western blots to confirm loss-of-function for several mutants. Additionally, we developed a DEB treatment assay by evaluating morphological changes in embryos and confirmed that homozygous mutants from all the FA genes that could be tested (11/17), displayed hypersensitivity and thus were indeed null alleles. Our multiplexing strategy helped us to evaluate 11 multiple gene knockout combinations without additional breeding. Homozygous zebrafish for all 19 single  and 11 multi-gene knockouts were adult viable, indicating FA genes in zebrafish are generally not essential for early development. None of the mutant fish displayed gross developmental abnormalities except for fancp-/- fish, which were  significantly smaller in length than their wildtype clutch mates. Complete female-to-male sex reversal was observed in knockouts for 12/17 FA genes, while partial sex reversal was seen for the other five gene knockouts. All adult females were fertile, and among the adult males, all were fertile except for the  fancd1 mutants and one of the fancj mutants. We report here generation and characterization of zebrafish knockout mutants for 17 FA disease-causing genes, providing an integral resource for understanding the pathophysiology associated with the disrupted FA pathway.","fish","ファンコニ貧血（FA）は、再生不良性貧血、発達異常、および血液学的およびその他の固形臓器悪性腫瘍の素因をもたらすゲノム不安定性症候群です。FA経路のタンパク質をコードする遺伝子の変異は、DNA鎖間架橋によって引き起こされるDNA損傷の修復を調整することができません。ゼブラフィッシュは、ほぼすべての既知のFA遺伝子のホモログを持っています。多重化されたCRISPR / Cas9を介した変異誘発を使用して、17のFA遺伝子（fanca、fancb、fancc、fancd1 / brca2、fancd2、fance、fancf、fancg、fanci、fancj / brip1、fancl、fancm、）の機能喪失変異体を生成しました。 fancn / palb2、fanco / rad51c、fancp / slx4、fancq / ercc4、fanct / ube2t、およびFA関連タンパク質をコードする2つの遺伝子：faap100とfaap24。2つを除くすべての遺伝子で早期のトランケーションを引き起こすと予測される2つのインデル変異を選択し、19の遺伝子で合計36の変異株が生成されました。各遺伝子に対して2つの独立した変異株を生成することは、それらの表現型の結果を検証するために重要でした。ホモ接合変異魚からのRT-PCRにより、すべての遺伝子にインデルを含む転写産物の存在が確認されました。興味深いことに、4つのインデル変異が異常なスプライシングを引き起こし、ゲノム配列から予測されたものとは異なるタンパク質を生成する可能性があります。したがって、RNAの分析は、ゼブラフィッシュのゲノムに導入された突然変異の結果を適切に評価する上で重要です。蛍光レポーターアッセイとウエスタンブロットを使用して、いくつかの変異体の機能喪失を確認しました。さらに、胚の形態学的変化を評価することによりDEB処理アッセイを開発し、テスト可能なすべてのFA遺伝子からのホモ接合変異体（11/17）が過敏症を示し、したがって実際にヌル対立遺伝子であることを確認しました。私たちの多重化戦略は、追加の繁殖なしで11の複数の遺伝子ノックアウトの組み合わせを評価するのに役立ちました。19個の単一遺伝子ノックアウトと11個の複数遺伝子ノックアウトすべてのホモ接合ゼブラフィッシュは成人で生存可能であり、ゼブラフィッシュのFA遺伝子は一般に初期の発達に必須ではないことを示しています。野生型のクラッチメイトよりも長さが有意に小さかったfancp-/-魚を除いて、変異魚はいずれも肉眼的発達異常を示さなかった。12/17 FA遺伝子のノックアウトでは、完全な女性から男性への性転換が観察されましたが、他の5つの遺伝子ノックアウトでは部分的な性転換が見られました。成体の雌はすべて繁殖力があり、成体の雄の中で、fancd1変異体とfancj変異体の1つを除いてすべてが繁殖力がありました。ここでは、17のFA疾患を引き起こす遺伝子のゼブラフィッシュノックアウト変異体の生成と特性評価を報告し、破壊されたFA経路に関連する病態生理学を理解するための不可欠なリソースを提供します。"]
[181,30427827,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","tbx20; fleer; aldh1a2; tcf21","PLoS genetics","Conditional mutagenesis by oligonucleotide-mediated integration of loxP sites in  zebrafish.",2018,"14(11):e1007754","[Burg L  et al.]","Temple University, Philadelphia, PA, USA.",30427827,"10.1371/journal.pgen.1007754 ","Many eukaryotic genes play essential roles in multiple biological processes in several different tissues. Conditional mutants are needed to analyze genes with such pleiotropic functions. In vertebrates, conditional gene inactivation has only been feasible in the mouse, leaving other model systems to rely on surrogate experimental approaches such as overexpression of dominant negative proteins and  antisense-based tools. Here, we have developed a simple and straightforward method to integrate loxP sequences at specific sites in the zebrafish genome using the CRISPR/Cas9 technology and oligonucleotide templates for homology directed repair. We engineered conditional (floxed) mutants of tbx20 and fleer, and demonstrate excision of exons flanked by loxP sites using tamoxifen-inducible CreERT2 recombinase. To demonstrate broad applicability of our method, we also integrated loxP sites into two additional genes, aldh1a2 and tcf21. The ease of this approach will further expand the use of zebrafish to study various aspects of vertebrate biology, especially post-embryonic processes such as regeneration.","fish","多くの真核生物の遺伝子は、いくつかの異なる組織の複数の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。このような多面発現機能を持つ遺伝子を分析するには、条件付き変異体が必要です。脊椎動物では、条件付き遺伝子の不活性化はマウスでのみ実現可能であり、他のモデルシステムはドミナントネガティブタンパク質の過剰発現やアンチセンスベースのツールなどの代理実験アプローチに依存することになります。ここでは、CRISPR / Cas9テクノロジーと相同性指向修復用のオリゴヌクレオチドテンプレートを使用して、ゼブラフィッシュゲノムの特定の部位にloxP配列を統合するためのシンプルで直接的な方法を開発しました。tbx20とfleerの条件付き（floxed）変異体を設計し、タモキシフェン誘導性CreERT2リコンビナーゼを使用してloxP部位に隣接するエクソンの切除を示します。私たちの方法の幅広い適用性を実証するために、loxP部位を2つの追加遺伝子、aldh1a2とtcf21に統合しました。このアプローチの容易さは、脊椎動物の生物学のさまざまな側面、特に再生などの胚後のプロセスを研究するためのゼブラフィッシュの使用をさらに拡大します。"]
[182,30372441,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","eTw5-7","PLoS genetics","Unraveling the transcriptional regulation of TWIST1 in limb development.",2018,"14(10):e1007738","[Hirsch N et al.]","Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva, Israel.",30372441,"10.1371/journal.pgen.1007738 ","The transcription factor TWIST1 plays a vital role in mesoderm development, particularly in limb and craniofacial formation. Accordingly, haploinsufficiency  of TWIST1 can cause limb and craniofacial malformations as part of Saethre-Chotzen syndrome. However, the molecular basis of TWIST1 transcriptional  regulation during development has yet to be elucidated. Here, we characterized active enhancers in the TWIST1-HDAC9 locus that drive transcription in the developing limb and branchial arches. Using available p300 and H3K27ac ChIP-seq data, we identified 12 enhancer candidates, located both within and outside the coding sequences of the neighboring gene, Histone deacetyase 9 (HDAC9). Using zebrafish and mouse enhancer assays, we showed that eight of these candidates have limb/fin and branchial arch enhancer activity that resemble Twist1 expression. Using 4C-seq, we showed that the Twist1 promoter region interacts with three enhancers (eTw-5, 6, 7) in the limb bud and branchial arch of mouse embryos at day 11.5. Furthermore, we found that two transcription factors, LMX1B  and TFAP2, bind these enhancers and modulate their enhancer activity. Finally, using CRISPR/Cas9 genome editing, we showed that homozygous deletion of eTw5-7 enhancers reduced Twist1 expression in the limb bud and caused pre-axial polydactyly, a phenotype observed in Twist1+/- mice. Taken together, our findings reveal that each enhancer has a discrete activity pattern, and together comprise  a spatiotemporal regulatory network of Twist1 transcription in the developing limbs/fins and branchial arches. Our study suggests that mutations in TWIST1 enhancers could lead to reduced TWIST1 expression, resulting in phenotypic outcome as seen with TWIST1 coding mutations.","fish","転写因子TWIST1は、中胚葉の発達、特に四肢と頭蓋顔面の形成に重要な役割を果たします。したがって、TWIST1のハプロ不全は、Saethre-Chotzen症候群の一部として四肢および頭蓋顔面奇形を引き起こす可能性があります。ただし、開発中のTWIST1転写調節の分子基盤はまだ解明されていません。ここでは、TWIST1-HDAC9遺伝子座のアクティブなエンハンサーを特徴づけ、発達中の四肢と鰓弓の転写を促進します。利用可能なp300およびH3K27acChIP-seqデータを使用して、隣接遺伝子であるヒストンデアセチアゼ9（HDAC9）のコード配列の内側と外側の両方にある12のエンハンサー候補を特定しました。ゼブラフィッシュとマウスエンハンサーアッセイを使用して、これらの候補のうち8つがTwist1の発現に似た肢/ひれと鰓弓エンハンサー活性を持っていることを示しました。4C-seqを使用して、Twist1プロモーター領域が11。5日目にマウス胚の肢芽および鰓弓の3つのエンハンサー（eTw-5、6、7）と相互作用することを示しました。さらに、LMX1BとTFAP2の2つの転写因子がこれらのエンハンサーに結合し、それらのエンハンサー活性を調節することを発見しました。最後に、CRISPR / Cas9ゲノム編集を使用して、eTw5-7エンハンサーのホモ接合性欠失が肢芽のTwist1発現を減少させ、Twist1 +/-マウスで観察される表現型である軸前多指症を引き起こすことを示しました。一緒に取られて、私たちの調査結果は、各エンハンサーが個別の活動パターンを持っており、一緒に発達中の手足/ひれと鰓弓におけるTwist1転写の時空間調節ネットワークを構成することを明らかにします。私たちの研究は、TWIST1エンハンサーの変異がTWIST1発現の低下につながる可能性があり、TWIST1コーディング変異で見られるような表現型の結果をもたらす可能性があることを示唆しています。"]
[183,30157172,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","clcc1","PLoS genetics","Mutation in the intracellular chloride channel CLCC1 associated with autosomal recessive retinitis pigmentosa.",2018,"14(8):e1007504","[Li L et al.]","Shanghai JiaoTong  University School of Medicine, Shanghai, China.",30157172,"10.1371/journal.pgen.1007504 ","We identified a homozygous missense alteration (c.75C>A, p.D25E) in CLCC1, encoding a presumptive intracellular chloride channel highly expressed in the retina, associated with autosomal recessive retinitis pigmentosa (arRP) in eight  consanguineous families of Pakistani descent. The p.D25E alteration decreased CLCC1 channel function accompanied by accumulation of mutant protein in granules  within the ER lumen, while siRNA knockdown of CLCC1 mRNA induced apoptosis in cultured ARPE-19 cells. TALEN KO in zebrafish was lethal 11 days post fertilization. The depressed electroretinogram (ERG) cone response and cone spectral sensitivity of 5 dpf KO zebrafish and reduced eye size, retinal thickness, and expression of rod and cone opsins could be rescued by injection of wild type CLCC1 mRNA. Clcc1+/- KO mice showed decreased ERGs and photoreceptor number. Together these results strongly suggest that intracellular chloride transport by CLCC1 is a critical process in maintaining retinal integrity, and CLCC1 is crucial for survival and function of retinal cells.","fish","CLCC1でホモ接合型ミスセンス変異（c.75C> A、p.D25E）を特定し、網膜で高度に発現していると推定される細胞内クロライドチャネルをコードし、パキスタン系の8つの血族家族における常染色体劣性網膜色素変性症（arRP）に関連しています。p.D25Eの変化は、ER内腔内の顆粒における変異タンパク質の蓄積を伴うCLCC1チャネル機能を低下させ、CLCC1mRNAのsiRNAノックダウンは培養ARPE-19細胞のアポトーシスを誘導しました。ゼブラフィッシュのTALENKOは、受精後11日で致命的でした。5 dpf KOゼブラフィッシュの網膜電図（ERG）錐体応答と錐体スペクトル感度の低下、および目のサイズ、網膜の厚さ、桿体および錐体オプシンの発現の減少は、野生型CLCC1mRNAの注射によって救済できます。Clcc1 +/- KOマウスは、ERGと視細胞数の減少を示しました。これらの結果を総合すると、CLCC1による細胞内塩化物輸送は網膜の完全性を維持する上で重要なプロセスであり、CLCC1は網膜細胞の生存と機能にとって重要であることが強く示唆されています。"]
[184,30110327,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","smyd4","PLoS genetics","The roles of SMYD4 in epigenetic regulation of cardiac development in zebrafish.",2018,"14(8):e1007578","[Xiao D  et al.]","Fudan University, Shanghai, China.",30110327,"10.1371/journal.pgen.1007578 ","SMYD4 belongs to a family of lysine methyltransferases. We analyzed the role of smyd4 in zebrafish development by generating a smyd4 mutant zebrafish line (smyd4L544Efs*1) using the CRISPR/Cas9 technology. The maternal and zygotic smyd4L544Efs*1 mutants demonstrated severe cardiac malformations, including defects in left-right patterning and looping and hypoplastic ventricles, suggesting that smyd4 was critical for heart development. Importantly, we identified two rare SMYD4 genetic variants in a 208-patient cohort with congenital heart defects. Both biochemical and functional analyses indicated that SMYD4(G345D) was pathogenic. Our data suggested that smyd4 functions as a histone methyltransferase and, by interacting with HDAC1, also serves as a potential modulator for histone acetylation. Transcriptome and bioinformatics analyses of smyd4L544Efs*1 and wild-type developing hearts suggested that smyd4 is a key epigenetic regulator involved in regulating endoplasmic reticulum-mediated protein processing and several important metabolic pathways in developing zebrafish hearts.","fish","SMYD4はリジンメチルトランスフェラーゼのファミリーに属しています。CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してsmyd4変異ゼブラフィッシュ系統（smyd4L544Efs * 1）を生成することにより、ゼブラフィッシュの発生におけるsmyd4の役割を分析しました。母体および接合体のsmyd4L544Efs * 1変異体は、左右のパターン形成とループの欠陥および形成不全の心室を含む重度の心臓奇形を示し、smyd4が心臓の発達に重要であることを示唆しています。重要なことに、先天性心臓欠損のある208人の患者コホートで2つのまれなSMYD4遺伝子変異体を特定しました。生化学的分析と機能的分析の両方で、SMYD4（G345D）が病原性であることが示されました。私たちのデータは、smyd4がヒストンメチルトランスフェラーゼとして機能し、HDAC1と相互作用することにより、ヒストンアセチル化の潜在的なモジュレーターとしても機能することを示唆しています。smyd4L544Efs * 1および野生型発達中の心臓のトランスクリプトームおよびバイオインフォマティクス分析は、smyd4が小胞体を介したタンパク質プロセシングおよびゼブラフィッシュ心臓の発達におけるいくつかの重要な代謝経路の調節に関与する重要なエピジェネティックレギュレーターであることを示唆しました。"]
[185,30080860,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","krox20","PLoS genetics","Cooperation, cis-interactions, versatility and evolutionary plasticity of multiple cis-acting elements underlie krox20 hindbrain regulation.",2018,"14(8):e1007581","[Torbey P et al.]","Ecole normale superieure, CNRS, Inserm, PSL Universite, Paris, France.",30080860,"10.1371/journal.pgen.1007581 ","Cis-regulation plays an essential role in the control of gene expression, and is  particularly complex and poorly understood for developmental genes, which are subject to multiple levels of modulation. In this study, we performed a global analysis of the cis-acting elements involved in the control of the zebrafish developmental gene krox20. krox20 encodes a transcription factor required for hindbrain segmentation and patterning, a morphogenetic process highly conserved during vertebrate evolution. Chromatin accessibility analysis reveals a cis-regulatory landscape that includes 6 elements participating in the control of initiation and autoregulatory aspects of krox20 hindbrain expression. Combining transgenic reporter analyses and CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, we assign precise functions to each of these 6 elements and provide a comprehensive view of krox20 cis-regulation. Three important features emerged. First, cooperation between multiple cis-elements plays a major role in the regulation. Cooperation can surprisingly combine synergy and redundancy, and is not restricted to transcriptional enhancer activity (for example, 4 distinct elements cooperate through different modes to maintain autoregulation). Second, several elements are unexpectedly versatile, which allows them to be involved in different aspects of  control of gene expression. Third, comparative analysis of the elements and their activities in several vertebrate species reveals that this versatility is underlain by major plasticity across evolution, despite the high conservation of  the gene expression pattern. These characteristics are likely to be of broad significance for developmental genes.","fish","Cis-regulationは、遺伝子発現の制御に不可欠な役割を果たしており、特に複雑で、複数のレベルの変調を受ける発生遺伝子についてはよく理解されていません。この研究では、ゼブラフィッシュの発生遺伝子krox20の制御に関与するシス作用エレメントのグローバル分析を実行しました。krox20は、脊椎動物の進化中に高度に保存された形態形成プロセスである、後脳のセグメンテーションとパターン化に必要な転写因子をエンコードします。クロマチンアクセシビリティ分析は、krox20後脳発現の開始と自己調節の側面の制御に関与する6つの要素を含むシス調節の風景を明らかにします。トランスジェニックレポーター分析とCRISPR / Cas9を介した突然変異誘発を組み合わせて、これら6つの要素のそれぞれに正確な機能を割り当て、krox20シス調節の包括的なビューを提供します。3つの重要な機能が登場しました。第一に、複数のシスエレメント間の協力が規制において主要な役割を果たしています。協力は驚くべきことに相乗効果と冗長性を組み合わせることができ、転写エンハンサー活性に制限されません（たとえば、4つの異なる要素が異なるモードを介して協力して自動調整を維持します）。第二に、いくつかの要素は予想外に用途が広く、遺伝子発現の制御のさまざまな側面に関与することができます。第三に、いくつかの脊椎動物種における要素とその活性の比較分析は、遺伝子発現パターンの高度な保存にもかかわらず、この多様性が進化全体にわたる主要な可塑性によって裏付けられていることを明らかにしています。これらの特徴は、発生遺伝子にとって幅広い意味を持つ可能性があります。"]
[186,30481179,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","regulatory  subunit of protein phosphatase 2A (pr72)","PloS one","Deletion of Pr72 causes cardiac developmental defects in Zebrafish.",2018,"13(11):e0206883","[Song G et al.]","Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan, China.",30481179,"10.1371/journal.pone.0206883 ","The alpha regulator subunit B'' of protein phosphatase 2 (PPP2R3A), a regulatory  subunit of protein phosphatase 2A (PP2A), was reported to present a special subcellular localization in cardiomyocytes and elevate in non-ischemia failing hearts. PPP2R3A has two transcriptions PR72 and PR130. PR72 acts as a negative regulator of the Wnt signaling cascade, while the Wnt signaling cascade plays a pivotal role in cardiac development. And PR130 was found to be involved in cardiac development of zebrafish in our previous study. Thus, to investigate the  function of PR72 in heart, two stable pr72 knockout (KO) zebrafish lines were generated using Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) technology. Homozygous pr72 KO fish struggled to survive to adulthood and exhibited cardiac developmental defects, including enlarged ventricular chambers, reduced cardiomyocytes and decreased cardiac function. And the defective sarcomere ultrastructure that affected mitochondria, I bands, Z lines, and intercalated disks was also observed. Furthermore, the abnormal heart looping was detected in mutants which could be rescued by injection with wild type pr72 mRNA. Additionally, it was found that Wnt effectors were elevated in mutants. Those indicated that deletion of pr72 in zebrafish interrupted cardiac development, probably through activation of the Wnt pathway.","fish","タンパク質ホスファターゼ2A（PP2A）の調節サブユニットであるタンパク質ホスファターゼ2（PPP2R3A）のアルファ調節サブユニットB ''は、心筋細胞に特別な細胞内局在を示し、非虚血性不全心臓で上昇することが報告されました。PPP2R3Aには、PR72とPR130の2つの転写があります。PR72はWntシグナル伝達カスケードの負の調節因子として機能し、Wntシグナル伝達カスケードは心臓の発達において極めて重要な役割を果たします。そして、PR130は私たちの以前の研究でゼブラフィッシュの心臓の発達に関与していることがわかりました。したがって、心臓におけるPR72の機能を調査するために、2つの安定したpr72ノックアウト（KO）ゼブラフィッシュ系統が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）技術を使用して生成されました。ホモ接合型のpr72KO魚は、成魚まで生き残るのに苦労し、心室の拡大、心筋細胞の減少、心機能の低下などの心臓発達障害を示しました。また、ミトコンドリア、Iバンド、Z線、介在板に影響を与える欠陥のあるサルコメアの超微細構造も観察されました。さらに、異常な心臓ループが変異体で検出され、野生型pr72mRNAの注射によって救済することができた。さらに、Wntエフェクターが変異体で上昇していることがわかった。それらは、ゼブラフィッシュにおけるpr72の削除が、おそらくWnt経路の活性化を通じて、心臓の発達を妨害したことを示した。"]
[187,30052645,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","eysrmc101/rmc101","PloS one","Eyes shut homolog is important for the maintenance of photoreceptor morphology and visual function in zebrafish.",2018,"13(7):e0200789","[Messchaert M et al.]","Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands.",30052645,"10.1371/journal.pone.0200789 ","Mutations in eyes shut homolog (EYS), a gene predominantly expressed in the photoreceptor cells of the retina, are among the most frequent causes of autosomal recessive (ar) retinitis pigmentosa (RP), a progressive retinal disorder. Due to the absence of EYS in several rodent species and its retina-specific expression, still little is known about the exact function of EYS and the pathogenic mechanism underlying EYS-associated RP. We characterized eys in zebrafish, by RT-PCR analysis on zebrafish eye-derived RNA, which led to the identification of a 8,715 nucleotide coding sequence that is divided over 46 exons. The transcript is predicted to encode a 2,905-aa protein that contains 39  EGF-like domains and five laminin A G-like domains, which overall shows 33% identity with human EYS. To study the function of EYS, we generated a stable eysrmc101/rmc101 mutant zebrafish model using CRISPR/Cas9 technology. The introduced lesion is predicted to result in premature termination of protein synthesis and lead to loss of Eys function. Immunohistochemistry on retinal sections revealed that Eys localizes at the region of the connecting cilium and that both rhodopsin and cone transducin are mislocalized in the absence of Eys. Electroretinogram recordings showed diminished b-wave amplitudes in eysrmc101/rmc101 zebrafish (5 dpf) compared to age- and strain-matched wild-type  larvae. In addition, decreased locomotor activity in response to light stimuli was observed in eys mutant larvae. Altogether, our study shows that absence of Eys leads to a disorganized retinal architecture and causes visual dysfunction in zebrafish.","fish","網膜の光受容細胞で主に発現する遺伝子であるアイシャットホモログ（EYS）の変異は、進行性網膜障害である常染色体劣性（ar）色素性網膜炎（RP）の最も頻繁な原因の1つです。いくつかのげっ歯類種にはEYSが存在せず、その網膜特異的発現があるため、EYSの正確な機能とEYS関連RPの根底にある病原性メカニズムについてはまだほとんどわかっていません。ゼブラフィッシュの眼由来RNAのRT-PCR分析により、ゼブラフィッシュのeyを特徴づけ、46のエキソンに分割された8,715ヌクレオチドのコード配列を同定しました。転写産物は、39個のEGF様ドメインと5個のラミニンA G様ドメインを含む2,905-aaタンパク質をコードすると予測され、全体としてヒトEYSと33％の同一性を示します。EYSの機能を研究するために、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して安定したeysrmc101 / rmc101変異ゼブラフィッシュモデルを生成しました。導入された病変は、タンパク質合成の早期終了をもたらし、Eys機能の喪失につながると予測されています。網膜切片の免疫組織化学により、Eysは接続繊毛の領域に局在し、ロドプシンと錐体トランスデューシンの両方がEysの非存在下で誤って局在化することが明らかになりました。網膜電図の記録は、年齢および系統が一致した野生型の幼虫と比較して、eysrmc101 / rmc101ゼブラフィッシュ（5 dpf）のb波振幅の減少を示しました。さらに、光刺激に応答した自発運動の低下がeys変異幼虫で観察された。全体として、私たちの研究は、Eysの欠如が無秩序な網膜構造につながり、ゼブラフィッシュの視覚機能障害を引き起こすことを示しています。"]
[188,29927984,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","Islet2a","PloS one","Investigation of Islet2a function in zebrafish embryos: Mutants and morphants differ in morphologic phenotypes and gene expression.",2018,"13(6):e0199233","[Moreno RL et al.]","University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO, USA.",29927984,"10.1371/journal.pone.0199233 ","Zebrafish primary motor neurons differ from each other with respect to morphology, muscle targets and electrophysiological properties. For example, CaP  has 2-3-fold larger densities of both inward and outward currents than do other motor neurons. We tested whether the transcription factor Islet2a, uniquely expressed in CaP, but not other primary motor neurons, plays a role in specifying its stereotypic electrophysiological properties. We used both TALEN-based gene editing and antisense morpholino approaches to disrupt Islet2a function. Our electrophysiology results do not support a specific role for Islet2a in determining CaP's unique electrical properties. However, we also found that the morphological phenotypes of CaP and a later-born motor neuron differed between islet2a mutants and morphants. Using microarrays, we tested whether the gene expression profiles of whole embryo morphants, mutants and controls also differed. Morphants had 174 and 201 genes that were differentially expressed compared to mutants and controls, respectively. Further, islet2a was identified as a differentially expressed gene. To examine how mutation of islet2a affected islet gene expression specifically in CaPs, we performed RNA in situ hybridization. We detected no obvious differences in expression of islet1, islet2a, or islet2b in CaPs of mutant versus sibling control embryos. However, immunolabeling studies revealed that an Islet protein persisted in CaPs of mutants, albeit at a reduced level compared to controls. While we cannot exclude  requirement for some Islet protein, we conclude that differentiation of the CaP's stereotypic large inward and outward currents does not have a specific requirement for Islet2a.","fish","ゼブラフィッシュの一次運動ニューロンは、形態、筋肉標的、および電気生理学的特性に関して互いに異なります。たとえば、CaPは、他の運動ニューロンよりも内向き電流と外向き電流の両方の密度が2〜3倍大きくなっています。CaPで一意に発現するが、他の一次運動ニューロンでは発現しない転写因子Islet2aが、その常同的な電気生理学的特性を特定する役割を果たすかどうかをテストしました。TALENベースの遺伝子編集とアンチセンスモルホリノアプローチの両方を使用して、Islet2a機能を破壊しました。私たちの電気生理学的結果は、CaPのユニークな電気的特性を決定する上でのIslet2aの特定の役割をサポートしていません。ただし、CaPと後に生まれた運動ニューロンの形態学的表現型がislet2a変異体と変異体の間で異なることも発見しました。マイクロアレイを使用して、全胚の変異体、変異体、およびコントロールの遺伝子発現プロファイルも異なるかどうかをテストしました。モルファントには、変異体および対照と比較してそれぞれ差次的に発現された174および201の遺伝子がありました。さらに、islet2aは差次的に発現する遺伝子として同定されました。islet2aの変異がCaPで特異的に膵島遺伝子発現にどのように影響するかを調べるために、RNAinsituハイブリダイゼーションを行いました。変異体と兄弟対照胚のCaPで、islet1、islet2a、またはislet2bの発現に明らかな違いは検出されませんでした。しかし、免疫標識研究により、Isletタンパク質は、対照と比較してレベルが低下しているにもかかわらず、変異体のCaPで持続することが明らかになりました。一部のIsletタンパク質の要件を除外することはできませんが、CaPの常同的な大きな内向きおよび外向きの電流の区別にはIslet2aの特定の要件はないと結論付けています。"]
[189,29715317,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","starmaker","PloS one","Candidate gene identification of ovulation-inducing genes by RNA sequencing with  an in vivo assay in zebrafish.",2018,"13(5):e0196544","[Klangnurak W et al.]","National University Corporation Shizuoka University, Shizuoka, Japan.",29715317,"10.1371/journal.pone.0196544 ","We previously reported the microarray-based selection of three ovulation-related  genes in zebrafish. We used a different selection method in this study, RNA sequencing analysis. An additional eight up-regulated candidates were found as specifically up-regulated genes in ovulation-induced samples. Changes in gene expression were confirmed by qPCR analysis. Furthermore, up-regulation prior to ovulation during natural spawning was verified in samples from natural pairing. Gene knock-out zebrafish strains of one of the candidates, the starmaker gene (stm), were established by CRISPR genome editing techniques. Unexpectedly, homozygous mutants were fertile and could spawn eggs. However, a high percentage  of unfertilized eggs and abnormal embryos were produced from these homozygous females. The results suggest that the stm gene is necessary for fertilization. In this study, we selected additional ovulation-inducing candidate genes, and a novel function of the stm gene was investigated.","fish","我々は以前、ゼブラフィッシュにおける3つの排卵関連遺伝子のマイクロアレイベースの選択を報告しました。この研究では、別の選択方法であるRNAシーケンシング分析を使用しました。さらに8つのアップレギュレートされた候補が、排卵誘発サンプルで特異的にアップレギュレートされた遺伝子として発見されました。遺伝子発現の変化は、qPCR分析によって確認されました。さらに、自然産卵中の排卵前のアップレギュレーションは、自然ペアリングからのサンプルで確認されました。候補の1つであるスターメーカー遺伝子（stm）の遺伝子ノックアウトゼブラフィッシュ株は、CRISPRゲノム編集技術によって確立されました。意外にも、ホモ接合変異体は繁殖力があり、卵を産むことができました。しかし、これらのホモ接合体の雌からは、未受精卵と異常胚の割合が高くなっています。この結果は、stm遺伝子が受精に必要であることを示唆しています。この研究では、追加の排卵誘発候補遺伝子を選択し、stm遺伝子の新しい機能を調査しました。"]
[190,29684067,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;"," ","PloS one","Chromatin accessibility is associated with CRISPR-Cas9 efficiency in the zebrafish (Danio rerio).",2018,"13(4):e0196238","[Uusi-Makela MIE  et al.]","University of Tampere, Tampere, Finland.",29684067,"10.1371/journal.pone.0196238 ","CRISPR-Cas9 technology is routinely applied for targeted mutagenesis in model organisms and cell lines. Recent studies indicate that the prokaryotic CRISPR-Cas9 system is affected by eukaryotic chromatin structures. Here, we show  that the likelihood of successful mutagenesis correlates with transcript levels during early development in zebrafish (Danio rerio) embryos. In an experimental setting, we found that guide RNAs differ in their onset of mutagenesis activity in vivo. Furthermore, some guide RNAs with high in vitro activity possessed poor  mutagenesis activity in vivo, suggesting the presence of factors that limit the mutagenesis in vivo. Using open access datasets generated from early developmental stages of the zebrafish, and guide RNAs selected from the CRISPRz database, we provide further evidence for an association between gene expression  during early development and the success of CRISPR-Cas9 mutagenesis in zebrafish  embryos. In order to further inspect the effect of chromatin on CRISPR-Cas9 mutagenesis, we analysed the relationship of selected chromatin features on CRISPR-Cas9 mutagenesis efficiency using publicly available data from zebrafish embryos. We found a correlation between chromatin openness and the efficiency of  CRISPR-Cas9 mutagenesis. These results indicate that CRISPR-Cas9 mutagenesis is influenced by chromatin accessibility in zebrafish embryos.","fish","CRISPR-Cas9テクノロジーは、モデル生物や細胞株の標的変異誘発に日常的に適用されています。最近の研究では、原核生物のCRISPR-Cas9システムが真核生物のクロマチン構造の影響を受けることが示されています。ここでは、成功した突然変異誘発の可能性がゼブラフィッシュ（Daniorerio）胚の初期発生中の転写レベルと相関していることを示しています。実験的な設定では、ガイドRNAはinvivoでの突然変異誘発活性の開始が異なることがわかりました。さらに、高いインビトロ活性を有するいくつかのガイドＲＮＡは、インビボでの突然変異誘発活性が低く、インビボでの突然変異誘発を制限する因子の存在を示唆している。ゼブラフィッシュの初期発生段階から生成されたオープンアクセスデータセット、およびCRISPRzデータベースから選択されたガイドRNAを使用して、初期発生中の遺伝子発現とゼブラフィッシュ胚におけるCRISPR-Cas9突然変異誘発の成功との関連のさらなる証拠を提供します。CRISPR-Cas9変異誘発に対するクロマチンの影響をさらに調べるために、ゼブラフィッシュの胚から公開されているデータを使用して、CRISPR-Cas9変異誘発効率に対する選択されたクロマチンの特徴の関係を分析しました。クロマチンの開放性とCRISPR-Cas9変異誘発の効率との間に相関関係があることがわかりました。これらの結果は、CRISPR-Cas9変異誘発がゼブラフィッシュ胚のクロマチンアクセシビリティに影響されることを示しています。"]
[191,29534099,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","foxq1a; foxq1b","PloS one","Genetic analysis of zebrafish homologs of human FOXQ1, foxq1a and foxq1b, in innate immune cell development and bacterial host response.",2018,"13(3):e0194207","[Earley AM et al.]","University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill,  NC, USA.",29534099,"10.1371/journal.pone.0194207 ","FOXQ1 is a member of the forkhead-box transcription factor family that has important functions in development, cancer, aging, and many cellular processes. The role of FOXQ1 in cancer biology has raised intense interest, yet much remains poorly understood. We investigated the possible function of the two zebrafish orthologs (foxq1a and foxq1b) of human FOXQ1 in innate immune cell development and function. We employed CRISPR-Cas9 targeted mutagenesis to create null mutations of foxq1a and foxq1b in zebrafish. Using a combination of molecular, cellular, and embryological approaches, we characterized single and double foxq1a bcz11 and foxq1b bcz18 mutants. This study provides the first genetic mutant analyses of zebrafish foxq1a and foxq1b. Interestingly, we found that foxq1a, but not foxq1b, was transcriptionally regulated during a bacterial response, while the expression of foxq1a was detected in sorted macrophages and upregulated in foxq1a-deficient mutants. However, the transcriptional response to E. coli challenge of foxq1a and foxq1b mutants was not significantly different from that  of their wildtype control siblings. Our data shows that foxq1a may have a role in modulating bacterial response, while both foxq1a and foxq1b are not required for  the development of macrophages, neutrophils, and microglia. Considering the implicated role of FOXQ1 in a vast number of cancers and biological processes, the foxq1a and foxq1b null mutants from this study provide useful genetic models  to further investigate FOXQ1 functions.","fish","FOXQ1は、発達、癌、老化、および多くの細胞プロセスにおいて重要な機能を持つフォークヘッドボックス転写因子ファミリーのメンバーです。癌生物学におけるFOXQ1の役割は強い関心を呼んでいますが、まだ十分に理解されていないままです。自然免疫細胞の発達と機能におけるヒトFOXQ1の2つのゼブラフィッシュオルソログ（foxq1aとfoxq1b）の可能な機能を調査しました。CRISPR-Cas9を標的とした突然変異誘発を採用して、ゼブラフィッシュにfoxq1aとfoxq1bのヌル突然変異を作成しました。分子的、細胞的、および発生学的アプローチの組み合わせを使用して、単一および二重のfoxq1abcz11およびfoxq1bbcz18変異体を特徴づけました。この研究は、ゼブラフィッシュfoxq1aとfoxq1bの最初の遺伝子変異分析を提供します。興味深いことに、foxq1aの発現はソートされたマクロファージで検出され、foxq1a欠損変異体でアップレギュレートされる一方で、foxq1bではなくfoxq1aが細菌応答中に転写調節されることがわかりました。ただし、foxq1aおよびfoxq1b変異体の大腸菌チャレンジに対する転写応答は、それらの野生型対照兄弟のそれと有意に異ならなかった。私たちのデータは、foxq1aが細菌の応答を調節する役割を果たしている可能性がある一方で、foxq1aとfoxq1bの両方がマクロファージ、好中球、およびミクログリアの発生に必要ではないことを示しています。膨大な数の癌および生物学的プロセスにおけるFOXQ1の関与する役割を考慮すると、この研究からのfoxq1aおよびfoxq1b null変異体は、FOXQ1機能をさらに調査するための有用な遺伝子モデルを提供します。"]
[192,29494622,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","aryl hydrocarbon receptor (AHR) 2","PloS one","AHR2 required for normal behavioral responses and proper development of the skeletal and reproductive systems in zebrafish.",2018,"13(3):e0193484","[Garcia GR et al.]","Oregon State University, Corvallis, OR, USA.",29494622,"10.1371/journal.pone.0193484 ","The aryl hydrocarbon receptor (AHR) is a conserved ligand-activated transcription factor required for proper vertebrate development and homeostasis. The inappropriate activation of AHR by ubiquitous pollutants can lead to adverse effects on wildlife and human health. The zebrafish is a powerful model system that provides a vertebrate data stream that anchors hypothesis at the genetic and cellular levels to observations at the morphological and behavioral level, in a high-throughput format. In order to investigate the endogenous functions of AHR,  we generated an AHR2 (homolog of human AHR)-null zebrafish line (ahr2osu1) using  the clustered, regulatory interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 precision genome editing method. In zebrafish, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) mediated toxicity requires AHR2. The AHR2-null line was resistant to TCDD-induced toxicity, indicating the line can be used to investigate the biological and toxicological functions of AHR2. The AHR2-null zebrafish exhibited decreased survival and fecundity compared to the wild type line. At 36 weeks, histological evaluations of the AHR2-null ovaries revealed a reduction of mature follicles when compared to wild type ovaries, suggesting AHR2 regulates follicle growth in zebrafish. AHR2-null adults had malformed cranial skeletal bones and severely damaged fins. Our data suggests AHR2 regulates some aspect(s) of neuromuscular and/or sensory system development, with impaired behavioral responses observed in larval and adult AHR2-null zebrafish. This study increases our understanding of the endogenous functions of  AHR, which may help foster a better understanding of the target organs and molecular mechanisms involved in AHR-mediated toxicities.","fish","アリール炭化水素受容体（AHR）は、適切な脊椎動物の発達と恒常性に必要な保存されたリガンド活性化転写因子です。遍在する汚染物質によるAHRの不適切な活性化は、野生生物と人間の健康に悪影響を与える可能性があります。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のデータストリームを提供する強力なモデルシステムであり、遺伝子レベルおよび細胞レベルでの仮説を、形態学的および行動レベルでの観察にハイスループット形式で固定します。AHRの内因性機能を調査するために、クラスター化された規制間隔の短いパリンドロームリピート（CRISPR）-Cas9精密ゲノム編集法を使用してAHR2（ヒトAHRのホモログ）-ヌルゼブラフィッシュ系統（ahr2osu1）を生成しました。ゼブラフィッシュでは、2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD）を介した毒性にはAHR2が必要です。AHR2-nullラインは、TCDDによって誘発される毒性に耐性があり、このラインを使用してAHR2の生物学的および毒物学的機能を調査できることを示しています。AHR2 nullゼブラフィッシュは、野生型系統と比較して、生存率と繁殖力の低下を示しました。36週目に、AHR2ヌル卵巣の組織学的評価により、野生型卵巣と比較した場合に成熟卵胞の減少が明らかになり、AHR2がゼブラフィッシュの卵胞成長を調節していることが示唆されました。AHR2ヌルの成人は、奇形の頭蓋骨格骨とひどく損傷したひれを持っていました。私たちのデータは、AHR2が神経筋および/または感覚系の発達のいくつかの側面を調節し、幼生および成体のAHR2ヌルゼブラフィッシュで行動反応の障害が観察されることを示唆しています。この研究は、AHRの内因性機能についての理解を深め、AHRを介した毒性に関与する標的臓器と分子メカニズムの理解を深めるのに役立つ可能性があります。"]
[193,29346415,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","osgep; tprkb","PloS one","Acute multi-sgRNA knockdown of KEOPS complex genes reproduces the microcephaly phenotype of the stable knockout zebrafish model.",2018,"13(1):e0191503","[Jobst-Schwan T  et al.]","Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA.",29346415,"10.1371/journal.pone.0191503 ","Until recently, morpholino oligonucleotides have been widely employed in zebrafish as an acute and efficient loss-of-function assay. However, off-target effects and reproducibility issues when compared to stable knockout lines have compromised their further use. Here we employed an acute CRISPR/Cas approach using multiple single guide RNAs targeting simultaneously different positions in  two exemplar genes (osgep or tprkb) to increase the likelihood of generating mutations on both alleles in the injected F0 generation and to achieve a similar  effect as morpholinos but with the reproducibility of stable lines. This multi single guide RNA approach resulted in median likelihoods for at least one mutation on each allele of >99% and sgRNA specific insertion/deletion profiles as revealed by deep-sequencing. Immunoblot showed a significant reduction for Osgep  and Tprkb proteins. For both genes, the acute multi-sgRNA knockout recapitulated  the microcephaly phenotype and reduction in survival that we observed previously  in stable knockout lines, though milder in the acute multi-sgRNA knockout. Finally, we quantify the degree of mutagenesis by deep sequencing, and provide a  mathematical model to quantitate the chance for a biallelic loss-of-function mutation. Our findings can be generalized to acute and stable CRISPR/Cas targeting for any zebrafish gene of interest.","fish","最近まで、モルホリノオリゴヌクレオチドは、急性かつ効率的な機能喪失アッセイとしてゼブラフィッシュで広く使用されてきました。ただし、安定したノックアウトラインと比較した場合のオフターゲット効果と再現性の問題は、それらのさらなる使用を危うくしました。ここでは、2つの模範的な遺伝子（osgepまたはtprkb）の異なる位置を同時にターゲットとする複数のシングルガイドRNAを使用する急性CRISPR / Casアプローチを採用して、注入されたF0世代の両方の対立遺伝子に変異を生成する可能性を高め、モルホリノと同様の効果を達成しましたしかし、安定したラインの再現性があります。このマルチシングルガイドRNAアプローチにより、各対立遺伝子で少なくとも1つの変異が99％を超える可能性が中央値になり、ディープシーケンスによって明らかになったsgRNA固有の挿入/削除プロファイルが得られました。イムノブロットは、OsgepおよびTprkbタンパク質の有意な減少を示しました。両方の遺伝子について、急性マルチsgRNAノックアウトは、安定したノックアウトラインで以前に観察された小頭の表現型と生存率の低下を再現しましたが、急性マルチsgRNAノックアウトでは軽度でした。最後に、ディープシーケンスによって突然変異誘発の程度を定量化し、二対立遺伝子の機能喪失型突然変異の可能性を定量化するための数学的モデルを提供します。私たちの調査結果は、関心のあるゼブラフィッシュ遺伝子をターゲットとする急性で安定したCRISPR / Casに一般化することができます。"]
[194,29293625,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","lymphocyte cytosolic protein 1 (actin-bundling protein L-plastin)","PloS one","Targeted deletion of the zebrafish actin-bundling protein L-plastin (lcp1).",2018,"13(1):e0190353","[Kell MJ et al.]","Northwestern University Feinberg School of Medicine / Stanley Manne Children's Research Center, Chicago, IL, USA.",29293625,"10.1371/journal.pone.0190353 ","Regulation of the cytoskeleton is essential for cell migration in health and disease. Lymphocyte cytosolic protein 1 (lcp1, also called L-plastin) is a hematopoietic-specific actin-bundling protein that is highly conserved in zebrafish, mice and humans. In addition, L-plastin expression is documented as both a genetic marker and a cellular mechanism contributing to the invasiveness of tumors and transformed cell lines. Despite L-plastin's role in both immunity and cancer, in zebrafish there are no direct studies of its function, and no mutant, knockout or reporter lines available. Using CRISPR-Cas9 genome editing, we generated null alleles of zebrafish lcp1 and examined the phenotypes of these  fish throughout the life cycle. Our editing strategy used gRNA to target the second exon of lcp1, producing F0 mosaic fish that were outcrossed to wild types  to confirm germline transmission. F1 heterozygotes were then sequenced to identify three unique null alleles, here called 'Charlie', 'Foxtrot' and 'Lima'.  In silico, each allele truncates the endogenous protein to less than 5% normal size and removes both essential actin-binding domains (ABD1 and ABD2). Although none of the null lines express detectable LCP1 protein, homozygous mutant zebrafish (-/-) can develop and reproduce normally, a finding consistent with that of the L-plastin null mouse (LPL -/-). However, such mice do have a profound immune defect when challenged by lung bacteria. Interestingly, we observed reduced long-term survival of zebrafish lcp1 -/- homozygotes (~30% below the expected numbers) in all three of our knockout lines, with greatest mortality corresponding to the period (4-6 weeks post-fertilization) when the innate immune system is functional, but the adaptive immune system is not yet mature. This suggests that null zebrafish may have reduced capacity to combat opportunistic infections, which are more easily transmissible in the aquatic environment. Overall, our novel mutant lines establish a sound genetic model and an enhanced platform for further studies of L-plastin gene function in hematopoiesis and cancer.","fish","細胞骨格の調節は、健康と病気における細胞移動に不可欠です。リンパ球サイトゾルタンパク質1（lcp1、L-プラスチンとも呼ばれる）は、ゼブラフィッシュ、マウス、およびヒトで高度に保存されている造血特異的なアクチンバンドルタンパク質です。さらに、L-プラスチンの発現は、腫瘍および形質転換細胞株の侵襲性に寄与する遺伝的マーカーおよび細胞メカニズムの両方として文書化されています。免疫と癌の両方におけるL-プラスチンの役割にもかかわらず、ゼブラフィッシュでは、その機能の直接的な研究はなく、変異体、ノックアウト、またはレポーターラインは利用できません。CRISPR-Cas9ゲノム編集を使用して、ゼブラフィッシュlcp1のヌル対立遺伝子を生成し、ライフサイクル全体でこれらの魚の表現型を調べました。私たちの編集戦略では、gRNAを使用してlcp1の2番目のエクソンをターゲットにし、生殖細胞系列の伝達を確認するために野生型と交配したF0モザイク魚を作成しました。次に、F1ヘテロ接合体を配列決定して、ここでは「チャーリー」、「フォックストロット」、「リマ」と呼ばれる3つの固有のヌル対立遺伝子を特定しました。インシリコでは、各対立遺伝子は内因性タンパク質を通常の5％未満のサイズに切り詰め、両方の必須アクチン結合ドメイン（ABD1およびABD2）を削除します。ヌルラインはいずれも検出可能なLCP1タンパク質を発現しませんが、ホモ接合変異ゼブラフィッシュ（-/-）は正常に発達および繁殖でき、L-プラスチンヌルマウス（LPL-/-）と一致する所見です。しかし、そのようなマウスは、肺のバクテリアによって攻撃されたとき、深刻な免疫欠陥を持っています。興味深いことに、3つのノックアウトラインすべてでゼブラフィッシュlcp1-/-ホモ接合体の長期生存率の低下（予想数より約30％低い）が観察され、最大の死亡率は次の期間（受精後4〜6週間）に対応します。生来の免疫システムは機能していますが、適応免疫システムはまだ成熟していません。これは、ヌルゼブラフィッシュが日和見感染と戦う能力が低下している可能性があることを示唆しています。日和見感染は、水生環境でより簡単に感染します。全体として、私たちの新しい変異株は、造血と癌におけるL-プラスチン遺伝子機能のさらなる研究のための健全な遺伝子モデルと強化されたプラットフォームを確立します。"]
[195,29610331,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","rac3b/rfng/sgca regulatory cluster","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Evolutionary emergence of the rac3b/rfng/sgca regulatory cluster refined mechanisms for hindbrain boundaries formation.",2018,"115(16):E3731-E3740","[Letelier J et al.]","Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas/Universidad Pablo Olavide, Sevilla, Spain.",29610331,"10.1073/pnas.1719885115 ","Developmental programs often rely on parallel morphogenetic mechanisms that guarantee precise tissue architecture. While redundancy constitutes an obvious selective advantage, little is known on how novel morphogenetic mechanisms emerge during evolution. In zebrafish, rhombomeric boundaries behave as an elastic barrier, preventing cell intermingling between adjacent compartments. Here, we identify the fundamental role of the small-GTPase Rac3b in actomyosin cable assembly at hindbrain boundaries. We show that the novel rac3b/rfng/sgca regulatory cluster, which is specifically expressed at the boundaries, emerged in the Ostariophysi superorder by chromosomal rearrangement that generated new cis-regulatory interactions. By combining 4C-seq, ATAC-seq, transgenesis, and CRISPR-induced deletions, we characterized this regulatory domain, identifying hindbrain boundary-specific cis-regulatory elements. Our results suggest that the capacity of boundaries to act as an elastic mesh for segregating rhombomeric cells evolved by cooption of critical genes to a novel regulatory block, refining the mechanisms for hindbrain segmentation.","fish","開発プログラムは、正確な組織構造を保証する並列形態形成メカニズムに依存することがよくあります。冗長性は明らかな選択的利点を構成しますが、進化中に新しい形態形成メカニズムがどのように出現するかについてはほとんど知られていません。ゼブラフィッシュでは、菱脳節の境界が弾性バリアとして機能し、隣接する区画間で細胞が混ざり合うのを防ぎます。ここでは、後脳境界でのアクトミオシンケーブルアセンブリにおけるsmall-GTPaseRac3bの基本的な役割を特定します。境界で特異的に発現する新規のrac3b / rfng / sgca調節クラスターが、新しいシス調節相互作用を生成する染色体再配列によってOstariophysiスーパーオーダーに出現したことを示します。4C-seq、ATAC-seq、transgenesis、およびCRISPRによる削除を組み合わせることにより、この調節ドメインの特性を明らかにし、後脳境界に固有のcis調節要素を特定しました。我々の結果は、菱脳節細胞を分離するための弾性メッシュとして機能する境界の能力が、重要な遺伝子の新規調節ブロックへの共選択によって進化し、後脳セグメンテーションのメカニズムを洗練することを示唆している。"]
[196,29930176,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","cystic fibrosis transmembrane conductance regulator","Reproduction","CFTR is required for the migration of primordial germ cells during zebrafish early embryogenesis.",2018,"156(3):261-268","[Liao H et al.]","Sichuan University, Chengdu, China.",29930176,"10.1530/REP-17-0681 ","Mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene  affect fertility in both sexes. However, the involvement of CFTR in regulating germ cell development remains largely unknown. Here, we used zebrafish model to investigate the role of CFTR in primordial germ cells (PGCs) development. We generated a cftr frameshift mutant zebrafish line using CRISPR/Cas9 technique and investigated the migration of PGCs during early embryo development. Our results showed that loss of Cftr impairs the migration of PGCs from dome stages onward. The migration of PGCs was also perturbed by treatment of CFTRinh-172, a gating-speci fi c CFTR channel inhibitor. Moreover, defected PGCs migration in cftr mutant embryos can be partially rescued by injection of WT but not other channel-defective mutant cftr mRNAs. Finally, we observed the elevation of cxcr4b, cxcl12a, rgs14a and ca15b, key factors involved in zebrafish PGCs migration, in cftr-mutant zebrafish embryos. Taken together, the present study revealed an important role of CFTR acting as an ion channel in regulating PGCs migration during early embryogenesis. Defect of which may impair germ cell development through elevation of key factors involved in cell motility and response to chemotactic gradient in PGCs.","fish","嚢胞性線維症膜コンダクタンスレギュレーター（CFTR）遺伝子の変異は、両性の生殖能力に影響を及ぼします。ただし、生殖細胞の発達の調節におけるCFTRの関与はほとんど知られていません。ここでは、ゼブラフィッシュモデルを使用して、始原生殖細胞（PGC）の発達におけるCFTRの役割を調査しました。CRISPR / Cas9技術を使用してcftrフレームシフト変異ゼブラフィッシュ系統を生成し、初期胚発生中のPGCの移動を調査しました。我々の結果は、Cftrの喪失がドーム段階以降のPGCの移動を損なうことを示した。PGCの移動は、ゲーティング特異的CFTRチャネル阻害剤であるCFTRinh-172の処理によっても混乱しました。さらに、cftr変異体胚における欠陥のあるPGCの移動は、WTの注射によって部分的に救済することができますが、他のチャネル欠損変異体cftrmRNAでは救済できません。最後に、cftr変異ゼブラフィッシュ胚において、ゼブラフィッシュPGCの移動に関与する重要な要因であるcxcr4b、cxcl12a、rgs14a、およびca15bの上昇を観察しました。まとめると、本研究は、初期胚形成中のPGCの移動を調節する際のイオンチャネルとして作用するCFTRの重要な役割を明らかにした。その欠陥は、細胞の運動性とPGCの走化性勾配への応答に関与する重要な要因の上昇を通じて生殖細胞の発達を損なう可能性があります。"]
[197,30185624,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","stem-loop binding protein (slbp2)","RNA","Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis.",2018,"24(12):1738-1748","[He WX et al.]","Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China.",30185624,"10.1261/rna.067090.118 ","Stem-loop binding protein (SLBP) is required for replication-dependent histone mRNA metabolism in mammals. Zebrafish possesses two slbps, and slbp1 is necessary for retinal neurogenesis. However, the detailed expression and function of slbp2  in zebrafish are still unknown. In this study, we first identified zebrafish slbp2 as an oocyte-specific maternal factor and then generated a maternal-zygotic slbp2 F3 homozygous mutant (MZslbp2Delta4(-/-)) using CRISPR/Cas9. The depletion  of maternal Slbp2 disrupted early nuclear cleavage, which resulted in developmental arrest at the MBT stage. The developmental defects could be rescued in slbp2 transgenic MZslbp2Delta4(-/-) embryos. However, homozygous mutant MZslbp1Delta1(-/-) developed normally, indicating slbp1 is dispensable for zebrafish early embryogenesis. Through comparative proteome and transcriptome profiling between WT and MZslbp2Delta4(-/-) embryos, we identified many differentially expressed proteins and genes. In comparison with those in WT embryos, four replication-dependent histones, including H2a, H2b, H3, and H4, all reduced their expression, while histone variant h2afx significantly increased in  MZslbp2Delta4(-/-) embryos at the 256-cell stage and high stage. Zebrafish Slbp2  can bind histone mRNA stem-loop in vitro, and the defects of MZslbp2Delta4(-/-) embryos can be partially rescued by overexpression of H2b. The current data indicate that maternal Slbp2 plays a pivotal role in the storage of replication-dependent histone mRNAs and proteins during zebrafish oogenesis.","fish","ステムループ結合タンパク質（SLBP）は、哺乳類の複製依存性ヒストンmRNA代謝に必要です。ゼブラフィッシュは2つのslbpsを持っており、slbp1は網膜の神経発生に必要です。ただし、ゼブラフィッシュにおけるslbp2の詳細な発現と機能はまだ不明です。この研究では、最初にゼブラフィッシュslbp2を卵母細胞特異的な母体因子として同定し、次にCRISPR / Cas9を使用して母体接合性slbp2F3ホモ接合性変異体（MZslbp2Delta4（-/-））を生成しました。母体のSlbp2の枯渇は、初期の核卵割を破壊し、MBT段階で発達停止をもたらしました。発達障害は、slbp2トランスジェニックMZslbp2Delta4（-/-）胚で救済することができます。ただし、ホモ接合変異体MZslbp1Delta1（-/-）は正常に開発され、slbp1がゼブラフィッシュの初期胚発生に不可欠であることを示しています。WT胚とMZslbp2Delta4（-/-）胚の間のプロテオームとトランスクリプトームの比較プロファイリングを通じて、多くの差次的に発現するタンパク質と遺伝子を同定しました。WT胚のものと比較して、H2a、H2b、H3、およびH4を含む4つの複製依存性ヒストンはすべてそれらの発現を減少させたが、ヒストンバリアントh2afxは256細胞期のMZslbp2Delta4（-/-）胚で有意に増加した。ハイステージ。ゼブラフィッシュSlbp2はinvitroでヒストンmRNAステムループに結合でき、MZslbp2Delta4（-/-）胚の欠陥はH2bの過剰発現によって部分的に救済することができます。現在のデータは、母体のSlbp2が、ゼブラフィッシュの卵形成中に複​​製依存性のヒストンmRNAとタンパク質の貯蔵に極めて重要な役割を果たしていることを示しています。"]
[198,30385465,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","SPRED1","Science","Human tumor genomics and zebrafish modeling identify SPRED1 loss as a driver of mucosal melanoma.",2018,"362(6418):1055-1060","[Ablain J  et al.]","Boston Children's Hospital and Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA.",30385465,"10.1126/science.aau6509 ","Melanomas originating from mucosal surfaces have low mutation burden, genomic instability, and poor prognosis. To identify potential driver genes, we sequenced hundreds of cancer-related genes in 43 human mucosal melanomas, cataloging point  mutations, amplifications, and deletions. The SPRED1 gene, which encodes a negative regulator of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling, was inactivated in 37% of the tumors. Four distinct genotypes were associated with SPRED1 loss. Using a rapid, tissue-specific CRISPR technique to model these genotypes in zebrafish, we found that SPRED1 functions as a tumor suppressor, particularly in the context of KIT mutations. SPRED1 knockdown caused MAPK activation, increased cell proliferation, and conferred resistance to drugs inhibiting KIT tyrosine kinase activity. These findings provide a rationale for MAPK inhibition in SPRED1-deficient melanomas and introduce a zebrafish modeling  approach that can be used more generally to dissect genetic interactions in cancer.","fish","粘膜表面に由来するメラノーマは、突然変異の負担が少なく、ゲノムが不安定で、予後が悪い。潜在的なドライバー遺伝子を特定するために、43のヒト粘膜メラノーマで数百の癌関連遺伝子を配列決定し、点の突然変異、増幅、および欠失をカタログ化しました。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達の負の調節因子をコードするSPRED1遺伝子は、腫瘍の37％で不活化されました。4つの異なる遺伝子型がSPRED1の喪失と関連していた。ゼブラフィッシュのこれらの遺伝子型をモデル化するための迅速な組織特異的CRISPR技術を使用して、SPRED1が特にKIT変異の状況で腫瘍抑制因子として機能することを発見しました。SPRED1ノックダウンは、MAPK活性化を引き起こし、細胞増殖を増加させ、KITチロシンキナーゼ活性を阻害する薬剤に対する耐性を付与しました。これらの発見は、SPRED1欠損黒色腫におけるMAPK阻害の理論的根拠を提供し、癌における遺伝的相互作用を分析するためにより一般的に使用できるゼブラフィッシュモデリングアプローチを紹介します。"]
[199,30337622,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","smarce1","Scientific reports","smarce1 mutants have a defective endocardium and an increased expression of cardiac transcription factors in zebrafish.",2018,"8(1):15369","[Castillo-Robles J et al.]","Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Cuernavaca, Morelos, Mexico.",30337622,"10.1038/s41598-018-33746-8 ","SWI/SNF or BAF chromatin-remodeling complexes are polymorphic assemblies of homologous subunit families that remodel nucleosomes and facilitate tissue-specific gene regulation during development. BAF57/SMARCE1 is a BAF complex subunit encoded in animals by a single gene and is a component of all mammalian BAF complexes. In vivo, the loss of SMARCE1 would lead to the formation of deficient combinations of the complex which might present limited remodeling activities. To address the specific contribution of SMARCE1 to the function of the BAF complex, we generated CRISPR/Cas9 mutations of smarce1 in zebrafish. Smarce1 mutants showed visible defects at 72 hpf, including smaller eyes, abnormal body curvature and heart abnormalities. Gene expression analysis revealed that the mutant embryos displayed defects in endocardial development since early stages, which led to the formation of a misshapen heart tube. The severe morphological and functional cardiac problems observed at 4 dpf were correlated with the substantially increased expression of different cardiac transcription factors. Additionally, we showed that Smarce1 binds to cis-regulatory regions of the gata5 gene and is necessary for the recruitment of  the BAF complex to these regions.","fish","SWI / SNFまたはBAFクロマチンリモデリング複合体は、ヌクレオソームをリモデリングし、発生中の組織特異的遺伝子調節を促進する相同サブユニットファミリーの多型アセンブリです。BAF57 / SMARCE1は、単一の遺伝子によって動物にコードされるBAF複合体サブユニットであり、すべての哺乳類BAF複合体の構成要素です。インビボでは、SMARCE1の喪失は、限られたリモデリング活動を示す可能性のある複合体の不十分な組み合わせの形成につながるでしょう。BAF複合体の機能に対するSMARCE1の特定の寄与に対処するために、ゼブラフィッシュでsmarce1のCRISPR / Cas9変異を生成しました。Smarce1変異体は、72 hpfで目に見える欠陥を示しました。これには、小さな目、異常な体の湾曲、心臓の異常などが含まれます。遺伝子発現解析により、変異胚は初期段階から心内膜の発達に欠陥を示し、それが奇形の心臓管の形成につながったことが明らかになった。4 dpfで観察された重度の形態学的および機能的な心臓の問題は、さまざまな心臓転写因子の発現の大幅な増加と相関していた。さらに、Smarce1がgata5遺伝子のシス調節領域に結合し、これらの領域へのBAF複合体の動員に必要であることを示しました。"]
[200,30190522,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","slc45a2","Scientific reports","A tRNA-based multiplex sgRNA expression system in zebrafish and its application to generation of transgenic albino fish.",2018,"8(1):13366","[Shiraki T et al.]","National Institute of Genetics,  Mishima, Shizuoka, Japan.",30190522,"10.1038/s41598-018-31476-5 ","The CRISPR/Cas9 system can be introduced into zebrafish as transgenes. Namely, expression of single-guide RNA (sgRNA) and controlled expression of Cas9 in transgenic zebrafish enables the study of gene functions in specific cell types.  This transgenic CRISPR/Cas9 approach would be more useful if multiple sgRNAs could be expressed simultaneously since we could knock-out a gene more efficiently or disrupt multiple genes simultaneously. Here we describe a novel system to express multiple sgRNAs efficiently in zebrafish, that relies on the endogenous tRNA processing machinery. We cloned nine endogenous zebrafish tRNA genes, fused them to sgRNAs, and demonstrated that an active sgRNA can be produced from a precursor transcript containing either of these tRNAs. To show a  proof of principle, we constructed transgenic fish expressing Cas9 under the control of the ubiquitin promoter and a single transcript containing three distinct sgRNAs, that targeted the slc45a2 (albino) gene, fused to tRNAs under the control of the U6 promoter. We found that the Tg(ubb:SpCas9,u6c:3xslc45a2-sgRNA) harbored mutations in all of the target sites  in the albino gene and showed nearly complete albino phenotypes, which were amenable to imaging experiments. Thus, the tRNA-based multiplex sgRNA expression  system should facilitate gene knock-out studies in transgenic zebrafish.","fish","CRISPR / Cas9システムは導入遺伝子としてゼブラフィッシュに導入することができます。つまり、トランスジェニックゼブラフィッシュにおけるシングルガイドRNA（sgRNA）の発現とCas9の制御された発現により、特定の細胞タイプにおける遺伝子機能の研究が可能になります。このトランスジェニックCRISPR / Cas9アプローチは、遺伝子をより効率的にノックアウトしたり、複数の遺伝子を同時に破壊したりできるため、複数のsgRNAを同時に発現させることができればより有用です。ここでは、内因性のtRNA処理機構に依存する、ゼブラフィッシュで複数のsgRNAを効率的に発現する新しいシステムについて説明します。9つの内因性ゼブラフィッシュtRNA遺伝子をクローン化し、それらをsgRNAに融合させ、これらのtRNAのいずれかを含む前駆体転写産物から活性sgRNAを生成できることを実証しました。原理の証明を示すために、ユビキチンプロモーターの制御下でCas9を発現するトランスジェニック魚と、U6プロモーターの制御下でtRNAに融合したslc45a2（アルビノ）遺伝子を標的とする3つの異なるsgRNAを含む単一の転写産物を構築しました。Tg（ubb：SpCas9、u6c：3xslc45a2-sgRNA）は、アルビノ遺伝子のすべての標的部位に変異があり、ほぼ完全なアルビノ表現型を示し、イメージング実験に適していることがわかりました。したがって、tRNAベースのマルチプレックスsgRNA発現システムは、トランスジェニックゼブラフィッシュにおける遺伝子ノックアウト研究を促進するはずです。"]
[201,29946172,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","photoreceptor cilium actin regulator 1","Scientific reports","C2orf71a/pcare1 is important for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish.",2018,"8(1):9675","[Corral-Serrano JC et al.]","Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands.",29946172,"10.1038/s41598-018-27928-7 ","Mutations in C2orf71 are causative for autosomal recessive retinitis pigmentosa and occasionally cone-rod dystrophy. We have recently discovered that the protein encoded by this gene is important for modulation of the ciliary membrane through  the recruitment of an actin assembly module, and have therefore renamed the gene  to PCARE (photoreceptor cilium actin regulator). Here, we report on the identification of two copies of the c2orf71/pcare gene in zebrafish, pcare1 and pcare2. To study the role of the gene most similar to human PCARE, pcare1, we have generated a stable pcare1 mutant zebrafish model (designated pcare1 (rmc100/rmc100) ) in which the coding sequence was disrupted using CRISPR/Cas9 technology. Retinas of both embryonic (5 dpf) and adult (6 mpf) pcare1 (rmc100/rmc100) zebrafish display a clear disorganization of photoreceptor outer  segments, resembling the phenotype observed in Pcare(-/-) mice. Optokinetic response and visual motor response measurements indicated visual impairment in pcare1 (rmc100/rmc100) zebrafish larvae at 5 dpf. In addition, electroretinogram  measurements showed decreased b-wave amplitudes in pcare1 (rmc100/rmc100) zebrafish as compared to age- and strain-matched wild-type larvae, indicating a defect in the transretinal current. Altogether, our data show that lack of pcare1 causes a retinal phenotype in zebrafish and indicate that the function of the PCARE gene is conserved across species.","fish","C2orf71の変異は、常染色体劣性網膜色素変性症の原因であり、錐体桿体ジストロフィーの原因となることもあります。最近、この遺伝子によってコードされるタンパク質が、アクチンアセンブリモジュールの動員を通じて繊毛膜の調節に重要であることを発見したため、遺伝子の名前をPCARE（光受容体繊毛アクチンレギュレーター）に変更しました。ここでは、ゼブラフィッシュ、pcare1とpcare2のc2orf71 / pcare遺伝子の2つのコピーの識別について報告します。ヒトPCAREに最も類似した遺伝子pcare1の役割を研究するために、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してコード配列が破壊された安定したpcare1変異ゼブラフィッシュモデル（pcare1（rmc100 / rmc100）と指定）を生成しました。胚性（5 dpf）と成体（6 mpf）の両方のpcare1（rmc100 / rmc100）ゼブラフィッシュの網膜は、Pcare（-/-）マウスで観察された表現型に似た、光受容体の外側セグメントの明らかな混乱を示します。視運動反応および視覚運動反応の測定は、5 dpfでのpcare1（rmc100 / rmc100）ゼブラフィッシュ幼生の視覚障害を示しました。さらに、エレクトロレチノグラム測定は、年齢および系統が一致した野生型幼虫と比較して、pcare1（rmc100 / rmc100）ゼブラフィッシュのb波振幅の減少を示し、経網膜電流の欠陥を示しています。全体として、私たちのデータは、pcare1の欠如がゼブラフィッシュの網膜表現型を引き起こし、PCARE遺伝子の機能が種間で保存されていることを示しています。"]
[202,29618800,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","pax2a; nkx2.4b; duox; duoxa; tshr","Scientific reports","A Rapid CRISPR/Cas-based Mutagenesis Assay in Zebrafish for Identification of Genes Involved in Thyroid Morphogenesis and Function.",2018,"8(1):5647","[Trubiroha A et al.]","Universite Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium.",29618800,"10.1038/s41598-018-24036-4 ","The foregut endoderm gives rise to several organs including liver, pancreas, lung and thyroid with important roles in human physiology. Understanding which genes and signalling pathways regulate their development is crucial for understanding developmental disorders as well as diseases in adulthood. We exploited unique advantages of the zebrafish model to develop a rapid and scalable CRISPR/Cas-based mutagenesis strategy aiming at the identification of genes involved in morphogenesis and function of the thyroid. Core elements of the mutagenesis assay comprise bi-allelic gene invalidation in somatic mutants, a non-invasive monitoring of thyroid development in live transgenic fish, complementary analyses of thyroid function in fixed specimens and quantitative analyses of mutagenesis efficiency by Illumina sequencing of individual fish. We  successfully validated our mutagenesis-phenotyping strategy in experiments targeting genes with known functions in early thyroid morphogenesis (pax2a, nkx2.4b) and thyroid functional differentiation (duox, duoxa, tshr). We also demonstrate that duox and duoxa crispants phenocopy thyroid phenotypes previously observed in human patients with bi-allelic DUOX2 and DUOXA2 mutations. The proposed combination of efficient mutagenesis protocols, rapid non-invasive phenotyping and sensitive genotyping holds great potential to systematically characterize the function of larger candidate gene panels during thyroid development and is applicable to other organs and tissues.","fish","前腸内胚葉は、肝臓、膵臓、肺、甲状腺など、人類の生理機能に重要な役割を果たすいくつかの臓器を生み出します。どの遺伝子とシグナル伝達経路がそれらの発達を調節するかを理解することは、発達障害と成人期の疾患を理解するために重要です。ゼブラフィッシュモデルの独自の利点を活用して、甲状腺の形態形成と機能に関与する遺伝子の同定を目的とした、迅速でスケーラブルなCRISPR / Casベースの突然変異誘発戦略を開発しました。突然変異誘発アッセイのコア要素には、体細胞突然変異体における二対立遺伝子遺伝子無効化、生きたトランスジェニック魚における甲状腺発達の非侵襲的モニタリング、固定標本における甲状腺機能の補完的分析、および個々の魚のイルミナ配列決定による突然変異誘発効率の定量分析が含まれる。初期の甲状腺形態形成（pax2a、nkx2.4b）および甲状腺機能分化（duox、duoxa、tshr）で既知の機能を持つ遺伝子を標的とする実験で、突然変異誘発表現型戦略の検証に成功しました。また、duoxおよびduoxa crispantsは、バイアレルDUOX2およびDUOXA2変異を持つヒト患者で以前に観察された甲状腺表現型を表現型コピーすることを示しています。効率的な突然変異誘発プロトコル、迅速な非侵襲的表現型および高感度遺伝子型の提案された組み合わせは、甲状腺の発達中のより大きな候補遺伝子パネルの機能を体系的に特徴づける大きな可能性を秘め、他の臓器や組織に適用できます。"]
[203,30281416,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","ush2a","Zebrafish","Poor Splice-Site Recognition in a Humanized Zebrafish Knockin Model for the Recurrent Deep-Intronic c.7595-2144A>G Mutation in USH2A.",2018,"15(6):597-609","[Slijkerman R et al.]","Radboud University Medical Center , Nijmegen, the Netherlands .",30281416,"10.1089/zeb.2018.1613 ","The frequent deep-intronic c.7595-2144A>G mutation in intron 40 of USH2A generates a high-quality splice donor site, resulting in the incorporation of a pseudoexon (PE40) into the mature transcript that is predicted to prematurely terminate usherin translation. Aberrant USH2A pre-mRNA splicing could be corrected in patient-derived fibroblasts using antisense oligonucleotides. With the aim to study the effect of the c.7595-2144A>G mutation and USH2A splice redirection on retinal function, a humanized zebrafish knockin model was generated, in which 670 basepairs of ush2a intron 40 were exchanged for 557 basepairs of the corresponding human sequence using an optimized CRISPR/Cas9-based protocol. However, in the retina of adult homozygous humanized  zebrafish, only 7.4% +/- 3.9% of ush2a transcripts contained the human PE40 sequence and immunohistochemical analyses revealed no differences in the usherin  expression and localization between the retina of humanized and wild-type zebrafish larvae. Nevertheless, we were able to partially correct aberrant ush2a  splicing using a PE40-targeting antisense morpholino. Our results indicate a clear difference in splice-site recognition by the human and zebrafish splicing machinery. Therefore, we propose a protocol in which the effect of human splice-modulating mutations is studied in a zebrafish-specific cell-based splice  assay before the generation of a humanized zebrafish knockin model.","fish","USH2Aのイントロン40で頻繁に発生するディープイントロニックc.7595-2144A> G変異により、高品質のスプライスドナーサイトが生成され、成熟した転写産物に疑似エキソン（PE40）が組み込まれ、アシェリンの翻訳が早期に終了すると予測されます。異常なUSH2AプレmRNAスプライシングは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して患者由来の線維芽細胞で修正することができます。c.7595-2144A> G変異とUSH2Aスプライスリダイレクトが網膜機能に及ぼす影響を研究する目的で、ヒト化ゼブラフィッシュノックインモデルが生成されました。このモデルでは、670ベースペアのush2aイントロン40が対応するヒトの557ベースペアと交換されました。最適化されたCRISPR / Cas9ベースのプロトコルを使用したシーケンス。ただし、成体のホモ接合性ヒト化ゼブラフィッシュの網膜では、ush2a転写産物の7.4％+ /-3.9％のみがヒトPE40配列を含み、免疫組織化学的分析により、ヒト化ゼブラフィッシュ幼虫と野生型ゼブラフィッシュ幼虫の網膜間でアシェリンの発現と局在に違いは見られませんでした。 。それにもかかわらず、PE40を標的とするアンチセンスモルホリノを使用して、異常なush2aスプライシングを部分的に修正することができました。私たちの結果は、人間とゼブラフィッシュのスプライシング機構によるスプライス部位の認識に明らかな違いがあることを示しています。したがって、人間化されたゼブラフィッシュノックインモデルの生成前に、ゼブラフィッシュ固有の細胞ベースのスプライスアッセイでヒトスプライス調節変異の影響を研究するプロトコルを提案します。"]
[204,30419815,"animal\n(fish)","zebrafish; sharks; ray-finned fish","CRISPR;Cas9;","Nucleoplasmin 2 (npm2a; npm2b)","BMC evolutionary biology","Double maternal-effect: duplicated nucleoplasmin 2 genes, npm2a and npm2b, with essential but distinct functions are shared by fish and tetrapods.",2018,"18(1):167","[Cheung CT et al.]","INRA LPGP UR1037, Campus de Beaulieu, Rennes, France.",30419815,"10.1186/s12862-018-1281-3 ","BACKGROUND: Nucleoplasmin 2 (npm2) is an essential maternal-effect gene that mediates early embryonic events through its function as a histone chaperone that  remodels chromatin. Recently, two npm2 (npm2a and npm2b) genes have been annotated in zebrafish. Thus, we examined the evolution of npm2a and npm2b in a variety of vertebrates, their potential phylogenetic relationships, and their biological functions using knockout models via the CRISPR/cas9 system. RESULTS: We demonstrated that the two npm2 duplicates exist in a wide range of vertebrates, including sharks, ray-finned fish, amphibians, and sauropsids, while npm2a was lost in coelacanth and mammals, as well as some specific teleost lineages. Using phylogeny and synteny analyses, we traced their origins to the early stages of vertebrate evolution. Our findings suggested that npm2a and npm2b resulted from an ancient local gene duplication, and their functions diverged although key protein domains were conserved. We then investigated their functions by examining their tissue distribution in a wide variety of species and found that they shared ovarian-specific expression, a key feature of maternal-effect genes. We also demonstrated that both npm2a and npm2b are maternally-inherited transcripts in vertebrates, and that they play essential, but distinct, roles in  early embryogenesis using zebrafish knockout models. Both npm2a and npm2b function early during oogenesis and may play a role in cortical granule function  that impact egg activation and fertilization, while npm2b is also involved in early embryogenesis. CONCLUSION: These novel findings will broaden our knowledge  on the evolutionary history of maternal-effect genes and underlying mechanisms that contribute to vertebrate reproductive success. In addition, our results demonstrate the existence of a newly described maternal-effect gene, npm2a, that  contributes to egg competence, an area that still requires further comprehension.","fish","背景：ヌクレオプラスミン2（npm2）は、クロマチンをリモデリングするヒストンシャペロンとしての機能を通じて初期胚発生を仲介する必須の母性効果遺伝子です。最近、2つのnpm2（npm2aとnpm2b）遺伝子がゼブラフィッシュで注釈が付けられました。したがって、CRISPR / cas9システムを介したノックアウトモデルを使用して、さまざまな脊椎動物におけるnpm2aとnpm2bの進化、それらの潜在的な系統発生関係、およびそれらの生物学的機能を調べました。結果：2つのnpm2の複製は、サメ、条鰭綱、両生類、竜弓類など、さまざまな脊椎動物に存在し、npm2aはシーラカンスや哺乳類、およびいくつかの特定の硬骨魚の系統で失われたことを示しました。系統発生とシンテニー分析を使用して、脊椎動物の進化の初期段階にそれらの起源をたどりました。私たちの調査結果は、npm2aとnpm2bは古代の局所的な遺伝子重複に起因し、主要なタンパク質ドメインは保存されているものの、それらの機能は分岐していることを示唆しました。次に、多種多様な種における組織分布を調べることによってそれらの機能を調査し、それらが母性効果遺伝子の重要な特徴である卵巣特異的発現を共有していることを発見しました。また、npm2aとnpm2bの両方が脊椎動物の母性遺伝転写物であり、ゼブラフィッシュノックアウトモデルを使用して初期胚発生において不可欠であるが異なる役割を果たしていることも示しました。npm2aとnpm2bはどちらも卵形成の初期に機能し、卵の活性化と受精に影響を与える皮質顆粒機能に関与している可能性がありますが、npm2bは初期胚形成にも関与しています。結論：これらの新しい発見は、母性効果遺伝子の進化の歴史と脊椎動物の生殖の成功に寄与する根本的なメカニズムに関する知識を広げるでしょう。さらに、私たちの結果は、新たに記述された母性効果遺伝子npm2aの存在を示しています。これは、さらに理解が必要な領域である卵子の能力に寄与します。"]